分子和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)介紹！

分子和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)介紹！

⒈核酸分子雜交技術(shù)

由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測(cè)方法的靈敏性，它已成為分子生物學(xué)中常用的基本技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測(cè)等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強(qiáng)度等）可按堿基互補(bǔ)原成雙鏈。雜交的雙方是待測(cè)核酸序列及探針（probe）,待測(cè)核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細(xì)胞總RNA。核酸探針是指用放射性核素、*或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或RNApian段。根據(jù)其來(lái)源和性質(zhì)可分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。

⒉固相雜交

固相雜交（solid-phase hybridization）是將變性的DNA固定于固體基質(zhì)（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進(jìn)行雜交，故也稱(chēng)為膜上印跡雜交。

⒊斑步雜交（dot hybridization）

是道先將被測(cè)的DNA或RNA變性后固定在濾膜上然后加入過(guò)量的標(biāo)記好的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。該法的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，事先不用限制性內(nèi)切酶消化或凝膠電永分離核酸樣品，可在同一張膜上同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)；根據(jù)斑點(diǎn)雜并的結(jié)果，可以推算出雜交陽(yáng)性的拷貝數(shù)。該法的缺點(diǎn)是不能鑒定所測(cè)基因的相對(duì)分子質(zhì)量，而且特異性較差，有一定比例的假陽(yáng)性。

⒋印跡雜交（blotting hybridization）

Southern印跡雜交：凝膠電離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNApian段，將凝膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNApian段轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤固定，再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的已標(biāo)記的探針進(jìn)行那時(shí)交反應(yīng)，用放射性自顯影或酶反應(yīng)顯色，檢測(cè)特定大小分子的含量。可進(jìn)行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RELP）等。

Northern印跡雜交:由Southerm印雜交法演變而來(lái)，其被測(cè)樣品是RNA。經(jīng)甲醛或聚乙二醛變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，進(jìn)行雜交反應(yīng)，以鑒定基中特定mRNA分子的量與大小。該法是研究基因表達(dá)常用的方法，可推臬出癌基因的表達(dá)程度。

⒌差異雜交（differential hybridization）

是將基因組文庫(kù)的重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用兩種混合的不同cDNA探針（如：轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性癌組織的mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA）分別與濾膜上的DNA雜交，分析兩張濾膜上對(duì)應(yīng)位置雜交信息以分離差異表達(dá)的基因。適用于基因組不太復(fù)雜的真核生物（如酵母）表達(dá)基因的比較，假陽(yáng)性率較低。但對(duì)基因組非常復(fù)雜的鹽酸核生物（如人），則因工作量太大，表達(dá)的序列所占百分比較低（僅5％左右），價(jià)值不大。

⒍cDNA微點(diǎn)隈雜交（cDNA microarray hybridization）

是指將cDNA克隆或cDNA的PCR產(chǎn)物以高度的列陣形式排布并結(jié)合于固相支持物上（如：尼龍膜或活化的載玻片）以微點(diǎn)陣，然后用混合的不同DNA探針與微點(diǎn)陣上的DNA進(jìn)行雜交。再利用熒光、化學(xué)發(fā)光、共聚焦顯微鏡等技術(shù)掃描微點(diǎn)陣上的雜交信息。它比差異雜交技術(shù)的效率高、速度快、成本低，適用于大規(guī)模的分析。已成商品問(wèn)世。其缺點(diǎn)是無(wú)法克服保守的同源序列及重序?qū)﹄s交信息的干擾。

⒎寡核苷酸微點(diǎn)隈雜交（oligonucleotide microarray hybridization）

是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共價(jià)結(jié)合于支持物表面，與平均長(zhǎng)度為20-50nt的混合RNA或cDNA探針進(jìn)行雜交，以提高雜交的特異性和靈敏度。應(yīng)用共聚焦顯微鏡可檢測(cè)跨越三個(gè)數(shù)量級(jí)的雜交信息。適用于低豐度mRNA的檢測(cè)，以區(qū)分基因家族不同成員的差異表達(dá)特征，或鑒定同一轉(zhuǎn)錄在不同組織和細(xì)胞中的選擇性剪接。但有工作量較大、成本較高、速度較慢等弱點(diǎn)。

⒏液相雜交（solution hbridization）

指使變性的待測(cè)核酸單鏈與放射笥核素標(biāo)記的已知的酸單鏈（探針）在溶液中保溫，使之形成雜交復(fù)合物。反應(yīng)結(jié)束后，用羥磷灰石法或酶解法將未被雜交的單鏈和雜交雙鏈分開(kāi)，然后結(jié)膈后在雜妝分子中的探針量，就可推算出被測(cè)的核酸量。

⒐遞減雜交（subtractive hybridizatio）

是利用兩種來(lái)源一致而功能不同的組織細(xì)胞提取mRNA（或逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA）,在一定的條件下以過(guò)量的驅(qū)動(dòng)mRNA或cDNA與測(cè)試的單鏈cDNA或mRNA進(jìn)行液相雜交，通過(guò)羥基磷灰石柱層析篩選除去兩者間同源的雜交體。經(jīng)多輪雜交策選、除去兩者之間相同的基因成分，保留特異表達(dá)的目的基因或工基因片段。以后者篩選cDNA文庫(kù)，可獲得特異表達(dá)的目的基因cDNA全長(zhǎng)序列。

⒑核酸原位雜交

用特定標(biāo)記的已知順序核酸作為探針與細(xì)胞級(jí)或組織切片中核酸進(jìn)行復(fù)性雜交并對(duì)其實(shí)行檢測(cè)的方法，稱(chēng)為核酸原位雜交（nucleic acid hybridization in situ）。用來(lái)檢測(cè)DNA在細(xì)胞核或染色休上的分布，與細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行雜交以研究該組織細(xì)胞中特定基因表達(dá)水閏；還用于細(xì)胞、組織中有無(wú)特異性菌、病毒檢測(cè)的研究。

該法的優(yōu)點(diǎn)是特異性高，可精確定位；能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響；不需要從組織中提取核酸，對(duì)于組織中含量極低的靶序列有*的敏感性；并可完整地保持組織與細(xì)胞的形態(tài)。因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)的研究，如基因定位、基因制失，基因易位、特異基因整合部物色檢測(cè)等研究。近年來(lái)由定性發(fā)展到定量，方法更為*。

⒒DNA分子克隆技術(shù)（也稱(chēng)基因克隆技術(shù)）

在體外將DNA分子片段與載體DNApian段連接，轉(zhuǎn)入細(xì)胞獲得大量拷貝的過(guò)程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步驟包括：制備目的基因→將目的基因與載體用限制性內(nèi)切酶切割和連接，制成DNA重組→導(dǎo)入宿主細(xì)胞→篩選、鑒定→擴(kuò)增和表達(dá)。載體（vecors）在細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制，并帶動(dòng)重組的分子片段共同增殖，從而產(chǎn)生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或NDApian段的大量拷貝，有了這些與親本分子*相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能，隨著引入的DNApian段不同，有兩種DNA庫(kù)，一種是基因組文庫(kù)（genomic library）,另一種是cDNA庫(kù)。

⒓核酸序列測(cè)定

DNA的堿基序列決定著基因的特性，DNA序列分析（測(cè)序，sequencing）是分子生物學(xué)重要的基本技術(shù)。無(wú)論從基因庫(kù)中篩選的癌基因或經(jīng)PCR法擴(kuò)增的基因，終均需進(jìn)行核酸序列分析，可藉以了解基因的精細(xì)結(jié)構(gòu)，獲得其限制性內(nèi)切酶圖譜，分析基因的突變及對(duì)功能的影響，幫助人工俁成基因、設(shè)計(jì)引物，以及研究腫瘤的分子發(fā)病機(jī)制等。測(cè)序是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的。目前常用的方法有Maxam-Gilbert的化學(xué)降解少和Sanger的雙脫氧法等，近年來(lái)已有DNA序列自動(dòng)測(cè)定儀問(wèn)世?；瘜W(xué)降解法是在DNA的pian段的5`端標(biāo)記核素，然后用專(zhuān)一性化學(xué)試劑將DNA特異地降解，在電泳和自顯影后，可得到從標(biāo)記端延伸的片段供測(cè)讀序列和進(jìn)行比較。一般能讀出200-250個(gè)核苷酸序列。雙脫氧法是采用核苷酸鏈終止劑，如：2`，3`-雙脫氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一種)摻入到DNA鏈中以終止鏈的延長(zhǎng)，與摻入4種正常的dNTP的混合物分成四組進(jìn)行反應(yīng)，這樣可得到一組結(jié)尾長(zhǎng)衙不一、不同專(zhuān)一性核苷酸鏈終止劑結(jié)尾的DNApian段，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影，可讀出合成的DNA核苷酸序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，可推算出模板DNA分子的序列。

化學(xué)降解法只需一化學(xué)試劑，重復(fù)性好，容易掌握；而雙脫氧法需單鏈模板、特異的寡核苷酸引物及高質(zhì)量的DNA聚合酶，便隨著M13噬菌體載體的發(fā)明和運(yùn)用，合成的引物容易獲得，測(cè)序技術(shù)不斷改進(jìn)，故此法已被廣泛應(yīng)用?；撗醴ǖ淖詣?dòng)激光熒光測(cè)序儀，使測(cè)工作更快速和簡(jiǎn)便，而且保證高度重復(fù)性。至于RNA測(cè)序現(xiàn)大多采用將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后同測(cè)序，然后反推RNA序列

⒔聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)簡(jiǎn)稱(chēng)PCR技術(shù)，是一種利用DNA變性和復(fù)性原理在體外進(jìn)行特定的DNApian斷高效擴(kuò)增的技術(shù)，可檢出微量靶序列（甚至少到1個(gè)拷貝）。在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。僅需用極少量模板，在一對(duì)引物介導(dǎo)下，在數(shù)小時(shí) 內(nèi)可擴(kuò)增至100萬(wàn)-200萬(wàn)份拷貝。PCR反應(yīng)分三步：變性、退火及延伸。以上三步為一循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)的模板，這樣經(jīng)過(guò)九小時(shí)的循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)循環(huán)的模板，這樣經(jīng)過(guò)數(shù)上時(shí)的循環(huán)后，可得到大量復(fù)制的特異性DNApian段。反應(yīng)條件一般為94℃變性30秒，55℃退火30秒，70-72℃延伸30-60秒，共進(jìn)行30次循環(huán)左右，后再延伸72℃5分鐘，4℃冷卻終止反應(yīng)。

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