色譜分析方法的基本原理！

色譜分析方法的基本原理！

色譜法，又稱層析法。根據(jù)其分離原理，有吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜與排阻色譜等方法。

⒈吸附色譜是利用吸附劑對(duì)被分離物質(zhì)的吸附能力不同，用溶劑或氣體洗脫，以使組分分離。常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、聚酰胺等有吸附活性的物質(zhì)。

⒉分配色譜是利用溶液中被分離物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)不同，以使組分分離。其中一相為液體，涂布或使之鍵合在固體載體上，稱固定相；另一相為液體或氣體，稱流動(dòng)相。常用的載體有硅膠、硅藻土、硅鎂型吸附劑與纖維素粉等。

⒊離子交換色譜是利用被分離物質(zhì)在離子交換樹脂上的離子交換勢(shì)不同而使組分分離。常用的有不同強(qiáng)度的陽(yáng)、陰離子交換樹脂，流動(dòng)相一般為水或含有有機(jī)溶劑的緩沖液。

⒋排阻色譜又稱凝膠色譜或凝膠滲透色譜，是利用被分離物質(zhì)分子量大小的不同和在填料上滲透程度的不同，以使組分分離。常用的填料有分子篩、葡聚糖凝膠、微孔聚合物、微孔硅膠或玻璃珠等，可根據(jù)載體和試樣的性質(zhì)，選用水或有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。

色譜法的分離方法，有柱色譜法、紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。色譜所用溶劑應(yīng)與試樣不起化學(xué)反應(yīng)，并應(yīng)用純度較高的溶劑。色譜時(shí)的溫度，除氣相色譜法或另有規(guī)定外，系指在室溫下操作。

分離后各成分的檢出，應(yīng)采用各單體中規(guī)定的方法。通常用柱色譜、紙色譜或薄層色譜分離有色物質(zhì)時(shí)，可根據(jù)其色帶進(jìn)行區(qū)分，對(duì)有些無(wú)色物質(zhì)，可在245-365nm的紫外燈下檢視。紙色譜或薄層色譜也可噴顯色劑使之顯色。薄層色譜還可用加有熒光物質(zhì)的薄層硅膠，采用熒光熄滅法檢視。用紙色譜進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)，可將色譜斑點(diǎn)部分剪下或挖取，用溶劑溶出該成分，再用分光光度法或比色法測(cè)定，也可用色譜掃描儀直接在紙或薄層板上測(cè)出，也可用色譜掃描儀直接以紙或薄層板上測(cè)出。柱色譜、氣相色譜和高效液相色譜可用接于色譜柱出口處的各種檢測(cè)器檢測(cè)。柱色譜還可分部收集流出液后用適宜方法測(cè)定。 柱色譜法

所用色譜管為內(nèi)徑均勻、下端縮口的硬質(zhì)玻璃管，下端用棉花或玻璃纖維塞住，管內(nèi)裝有吸附劑。色譜柱的大小，吸附劑的品種和用量，以及洗脫時(shí)的流速，均按各單體中的規(guī)定。吸附劑的顆粒應(yīng)盡可能保持大小均勻，以保證良好的分離效果，除另有規(guī)定外通常多采用直徑為0.07-0.15mm的顆粒。吸附劑的活性或吸附力對(duì)分離效果有影響，應(yīng)予注意。

吸附劑的填裝 干法：將吸附劑一次加入色譜管，振動(dòng)管壁使其均勻下沉，然后沿管壁緩緩加入開始層析時(shí)使用的流動(dòng)相，或?qū)⑸V管下端出口加活塞，加入適量的流動(dòng)相，旋開活使流動(dòng)相緩緩滴出，然后自管頂緩緩加入吸附劑，使其均勻地潤(rùn)濕下沉，在管內(nèi)形成松緊適度的吸附層。操作過(guò)程中應(yīng)保持有充分的流動(dòng)相留在吸附層的上面。濕法：將吸附劑與流動(dòng)相混合，攪拌以除去空氣泡，徐徐傾入色譜管中，然后再加入流動(dòng)相，將附著于管壁的吸附劑洗下，使色譜柱表面平整。 俟填裝吸附劑所用流動(dòng)相從色譜柱自然流下，液面將柱表面相平時(shí)，即加試樣溶液。

試樣的加入 除另有規(guī)定外，將試樣溶于層析時(shí)使用的流動(dòng)相中，再沿色譜管壁緩緩加入。注意勿使吸附劑翻起?；?qū)⒃嚇尤苡谶m當(dāng)?shù)娜軇┲?。與少量吸附劑混勻，再使溶劑揮發(fā)去盡后使呈松散狀；將混有試樣的吸附劑加在已制備好的色譜柱上面。如試樣在常用溶劑中不溶解，可將試樣與適量的吸附劑在乳缽中研磨混勻后加入。

洗脫 除另有規(guī)定外，通常按流動(dòng)相洗脫能力大小，遞增變換流動(dòng)相的品種和比例，分別分部收集流出液，至流出液中所含成分顯著減少或不再含有時(shí)，再改變流動(dòng)相的品種和比例。操作過(guò)程中應(yīng)保持有充分的流動(dòng)相留在吸附層的上面。

⒈紙色譜法

以紙為載體，用單一溶劑或混合溶劑進(jìn)行分配。亦即以紙上所含水分或其他物質(zhì)為固定相，用流動(dòng)相進(jìn)行展開的分配色譜法。

所用濾紙應(yīng)質(zhì)地均勻平整，具有一定機(jī)械強(qiáng)度，必須不含會(huì)影響色譜效果的雜質(zhì)，也不應(yīng)與所用顯色劑起作用，以免影響分離和鑒別效果，必要時(shí)可作特殊處理后再用。 試樣經(jīng)層析后可用比移值（Rf）表示各組成成分的位置（比移值=原點(diǎn)中心至色譜斑點(diǎn)中心的距離與原點(diǎn)中心至流動(dòng)相前沿的距離之比），由于影響比移值的因素較多，因此一般采用在相同實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)照物質(zhì)對(duì)比以確定其異同。作為單體鑒別時(shí)，試樣所顯主色譜斑點(diǎn)的顏色（或熒光）與供置，應(yīng)與對(duì)照（標(biāo)準(zhǔn)）樣所顯主色的譜斑點(diǎn)或供試品-對(duì)照品（1∶1）混合所顯的主色譜斑點(diǎn)相同。作為質(zhì)量指標(biāo)（純度）檢查時(shí)，可取一定量的試樣，經(jīng)展開后，按各單體的規(guī)定，檢視其所顯雜質(zhì)色譜斑點(diǎn)的個(gè)數(shù)或呈色（或熒光）的強(qiáng)度。作為含量測(cè)定時(shí)，可將色譜斑點(diǎn)剪下洗脫后，再用適宜的方法測(cè)定，也可用色譜掃描儀測(cè)定。

⑴下行法 所用色譜缸一般為圓形或長(zhǎng)方形玻璃缸，缸上有磨口玻璃蓋，應(yīng)能密閉，蓋上有孔，可插入分液漏斗，以加入流動(dòng)相。在近缸頂端有一用支架架起的玻璃槽作為流動(dòng)相的容器，槽內(nèi)有一玻璃棒，用以支持色譜濾紙使其自然下垂，避免流動(dòng)相沿濾紙與溶劑槽之間發(fā)生虹吸現(xiàn)象。

取適當(dāng)?shù)纳V濾紙按纖維長(zhǎng)絲方向切成適當(dāng)大小的紙條，離紙條上端適當(dāng)?shù)木嚯x（使色譜紙上端能足夠浸入溶劑槽內(nèi)的流動(dòng)相中，并使點(diǎn)樣基線能在溶劑槽側(cè)的玻璃支持棒下數(shù)厘米處）用鉛筆劃一點(diǎn)樣基線，必要時(shí)色譜紙下端可切成鋸齒形，以便于流動(dòng)相滴下。 將試樣溶于適當(dāng)?shù)娜軇┲?，制成一定濃度的溶劑。用微量吸管或微量注射器吸取溶劑，點(diǎn)于點(diǎn)樣基線上，溶液宜分次點(diǎn)加，每次點(diǎn)加后，俟其自然干燥、低溫烘干或經(jīng)溫?zé)釟饬鞔蹈?。樣點(diǎn)直徑一般不超過(guò)0.5cm，樣點(diǎn)通常應(yīng)為圓形。

將點(diǎn)樣后的色譜濾紙上端放在溶劑槽內(nèi)，并用玻璃棒壓住，使色譜紙通過(guò)槽側(cè)玻璃支持棒自然下垂，點(diǎn)樣基線在支持棒下數(shù)厘米處。色譜開始前，色譜缸內(nèi)用各單體中所規(guī)定的溶劑的蒸氣飽和，一般可在色譜缸底部放一裝有流動(dòng)相的平皿，或?qū)⒔辛鲃?dòng)相的濾紙條附著在色譜缸的內(nèi)壁上，放置一定時(shí)間，俟溶劑揮發(fā)使缸內(nèi)充滿飽和蒸氣。然后添加流動(dòng)相，使浸沒溶劑槽內(nèi)濾紙，流動(dòng)相即經(jīng)毛細(xì)管作用沿濾紙移動(dòng)進(jìn)行展開至規(guī)定距離后，取出濾紙，標(biāo)明流動(dòng)相前沿位置，俟流動(dòng)相揮散后按規(guī)定方法檢出色譜斑點(diǎn)。

⑵上行法 色譜缸基本和下行法相似，唯除去溶劑槽和支架，并在色譜缸蓋上的孔中加塞，塞中插入玻璃懸鉤，以便將點(diǎn)樣后的色譜濾紙掛在鉤上。色譜濾紙一般長(zhǎng)約25cm，寬度則視需要而定。必要時(shí)可將色譜濾紙卷成筒形。點(diǎn)樣基線距底邊約2.5cm，點(diǎn)樣方法與下行法相同。色譜缸內(nèi)加入適量流動(dòng)相，放置，俟流動(dòng)相蒸氣飽和后，再下降懸鉤，使色譜濾紙浸入流動(dòng)相約0.5cm，流動(dòng)相即經(jīng)毛細(xì)管作用沿色譜濾紙上升，除另有規(guī)定外，一般展開至15cm后，取出晾干，按規(guī)定方法檢視。

色譜可以向一個(gè)方向進(jìn)行，即單向色譜；也可進(jìn)行雙向色譜，即先向一個(gè)方向展開，取出，俟流動(dòng)相*揮發(fā)后，將濾紙轉(zhuǎn)90°，再用原流動(dòng)相或另一種流動(dòng)相進(jìn)行展。亦可多次展開，連續(xù)展或徑向色譜等。

⒉薄層色譜法

按各單體所規(guī)定的載體，放入適當(dāng)容器，加入適量水以配成懸浮液，在厚度均勻一致的50×200mm或200×200mm平滑玻璃板上將此懸浮液均布成0.25mm的厚度，風(fēng)干后一般在110度下干燥0.5-1h（或按單體規(guī)定）。

以離薄層板一端約25mm的位置作為點(diǎn)樣基線，用微量吸管按規(guī)定量吸取試樣液和對(duì)照（標(biāo)準(zhǔn)）液，點(diǎn)于基線上，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離在10mm以上，液點(diǎn)的直徑約3mm，風(fēng)干后，基線一端向下，將薄層板放入展開溶劑，溶劑層深10mm，并預(yù)經(jīng)開展溶劑的蒸汽飽和。在展開溶劑從基線上升至規(guī)定距離（一般為15cm）后，取出薄層板，風(fēng)干，然后按規(guī)定的方法，對(duì)斑點(diǎn)的位置和顏色進(jìn)行檢查。

⒊氣相色譜法

氣相色譜法是在以適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嘧龀傻闹軆?nèi)，利用氣體（載氣）作為移動(dòng)相，使試樣（氣體、液體或固體）在氣體狀態(tài)下展開，在色譜柱內(nèi)分離后，各種成分先后進(jìn)入檢測(cè)器，用記錄儀記錄色譜譜圖。 在對(duì)裝置進(jìn)行調(diào)試后，按各單體的規(guī)定條件調(diào)整柱管、檢測(cè)器、溫度和載氣流量。進(jìn)樣口溫度一般應(yīng)高于柱溫30-50度。如用火焰電離檢測(cè)器，其溫度應(yīng)等于或高于柱溫，但不得低于100度，以免水汽凝結(jié)。色譜上分析成分的峰的位置，以滯留時(shí)間（從注入試樣液到出現(xiàn)成分峰的時(shí)間）和滯留容量（滯留時(shí)間×載氣流量）來(lái)表示。這些在一定條件下，就能反應(yīng)出物質(zhì)所具有特殊值，并據(jù)此確定試樣成分。

根據(jù)色譜上出現(xiàn)的物質(zhì)成分的峰面積或峰高進(jìn)行定量。峰面積可用面積測(cè)定儀測(cè)定，按半寬度法求得（即以峰1/2處的峰寬×峰高求得）。峰高的測(cè)定方法是從峰高的頂點(diǎn)向記錄紙橫座標(biāo)準(zhǔn)垂線，找出此垂線與峰的兩下端聯(lián)結(jié)線的交點(diǎn)，即以此交點(diǎn)至峰頂點(diǎn)的距離長(zhǎng)度為峰高。

定量方法可分以下三種：

⑴內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)法 取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分，按依次增加或減少的已知階段量，各自分別加入各單體所規(guī)定的定量?jī)?nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中，調(diào)制標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取此標(biāo)準(zhǔn)液的一定量注入色譜柱，根據(jù)色譜圖取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分的峰面積和峰高和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積和峰高的比例為縱座標(biāo)，取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分量和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量之比，或標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分量為橫坐標(biāo)，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

然后按單體中所規(guī)定的方法調(diào)制試樣液。在調(diào)制試樣液時(shí)，預(yù)先加入與調(diào)制標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)等量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。然后按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的同樣條件下得出的色譜，求出被測(cè)成分的峰面積或峰高和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰積或峰高之比，再按標(biāo)準(zhǔn)曲線求出被測(cè)成分的含量。

所用的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，應(yīng)采用其峰面積的位置與被測(cè)成分的峰的位置盡可能接近并與被測(cè)成分以外的峰位置*分離的穩(wěn)定的物質(zhì)。

⑵標(biāo)準(zhǔn)曲線法 取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分 按依次增加或減少階段法，各自調(diào)制成標(biāo)準(zhǔn)液，注入一定量后，按色譜圖取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分的峰面積或峰高為縱座標(biāo)，而以標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分的含量為橫坐標(biāo)，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后按單體中所規(guī)定的方法制備試樣液。取試樣液按制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)相同的條件作出色譜，求出被測(cè)成分的峰面積和峰高，再按標(biāo)準(zhǔn)曲線求出被測(cè)成分的含量。

⑶峰面積百分率法 以色譜中所得各種成分的峰面積的總和為100，按各成分的峰面積總和之比，求出各成分的組成比率。

⒋氣液色譜法

這時(shí)所指的氣液色譜法，主要用于各種香料物質(zhì)的分析，基本條件和參數(shù)主要依照美國(guó)精油協(xié)會(huì)（EOA）于1979年所建議的方法。其基本原理、操作、標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)等均與上述氣相色譜法相同。

⑴柱 用304號(hào)合金所制不銹鋼管，長(zhǎng)3m，內(nèi)徑2.16-2.57mm，外徑3.18mm。底物：極性柱為聚乙二醇20M（Carbowax 20M）,分子量約2萬(wàn)；非極性柱為氣相色譜級(jí)甲基硅氧烷（SE-30），或二甲基硅氧烷（OV-1或OV-101）。底物濃度：重量的105。固體載體：10目或20目熔融煅燒過(guò)的硅藻土，經(jīng)硅烷化和酸洗后，其自由傾落密度為0.2g/cm3，小120目，大80目。裝填密度每cm3應(yīng)大于0.24g。

⑵載氣氦。低流量為每分鐘25-50ml。

⑶分析狀態(tài)

極性柱：起始溫度，低75度；終溫度，225度。升溫速度，每分鐘2-8度。

非極性柱：起始溫度，低75度；終溫度，不超過(guò)275度；升溫速度，每分鐘2-8度。

進(jìn)樣溫度：225-250度。試樣量：0.1-1ul。

百歐博偉生物（biobw）是北京的一家專業(yè)于生物技術(shù)的研究與廣泛運(yùn)用及推廣的高科技公司，位于北京企業(yè)林立的豐臺(tái)區(qū)造甲街，生物技術(shù)推廣及運(yùn)用早于2011年開始，成立公司于2013年一月。本公司主要提供色譜耗材、色譜儀器、固相萃取裝置、化學(xué)試劑、樣品瓶、氘燈、標(biāo)準(zhǔn)品、微生物技術(shù)、菌種保藏服務(wù)以及ATCC產(chǎn)品代理等產(chǎn)品及服務(wù)。微生物菌種查詢網(wǎng)