色譜柱信息

SRT-C SEC鍵合固定相是采用專(zhuān)利的表面修飾技術(shù)和5 μm的粒徑，通過(guò)在高純度具有良好機(jī)械穩(wěn)定性的硅膠基質(zhì)上鍵合均勻的納米厚度的親水涂層而制備得到。獨(dú)有的化學(xué)修飾技術(shù)可******控制親水涂層的厚度，從而確保柱與柱之間有著******的重現(xiàn)性。由于采用化學(xué)鍵合技術(shù)，且涂層覆蓋******，因此SRT-C SEC柱具有******的穩(wěn)定性。均勻的表面涂層******了分離的高效性。SRT-C SEC-100、SEC-150、SEC-300、SEC-500、SEC-1000 和 SEC-2000填料為窄粒徑分布的球形顆粒，孔徑分別為 100?、150?、300?、500?、1000?和2000?。精心設(shè)計(jì)的大孔體積（SRT-C SEC-150、300、500孔體積約為1.35 mL/g，SRT-C SEC-100、1000、2000 孔體積約為 1.0 mL/g）******了高的分離容量，從而具有******的分辨率。通過(guò)運(yùn)用獨(dú)有的勻漿裝填技術(shù)裝填得到的SRT-C SEC柱柱床密度均一穩(wěn)定，因此可******具有高的柱效。

由于采用創(chuàng)新的表面化學(xué)技術(shù)，以及擁有多種孔徑規(guī)格（從100?到2000?），SRT-C SEC柱可為各種分離應(yīng)用提供高分辨率和大回收率。應(yīng)用領(lǐng)域覆蓋了大分子量的生物分子（如蛋白質(zhì)、核酸）、小分子量的生物分子（如多肽、寡核苷酸）、天然聚合物（如多糖）、合成聚合物、生物細(xì)胞（如細(xì)菌和病毒）、納米材料（如納米顆粒）等。SRT-C SEC柱一般在緩沖溶液中進(jìn)行樣品的分離和檢測(cè)。

色譜柱特征參數(shù)

硅膠：球形、高純度（金屬含量<10ppm）

粒徑：5μm

圖1. 蛋白混合樣在SRT-C SEC-300柱上的分離色譜圖。

色譜柱：SRT-C SEC-300 (7.8x300 mm, 5 μm)；

流動(dòng)相：150 mM 磷酸鹽緩沖鹽，pH 7.0；

流速：1.0 mL/min；

檢測(cè)波長(zhǎng)：UV 214 nm；

溫度：室溫 (23 ℃)；

進(jìn)樣量：10 µL；

蛋白混合物：1) 甲狀腺球蛋白，670 kD；2) γ-球蛋白, 158 kD；3) 卵清蛋白, 44 kD；4) 肌球蛋白, 17.6 kD；5) 聚丙氨酸, 1-5 kD；6) 尿嘧啶，120D。

孔徑：

100 ?,  適用蛋白分子量范圍100 ~ 100,000

150 ?, 適用蛋白分子量范圍500 ~ 150,000

300 ?, 適用蛋白分子量范圍5,000 ~ 1,250,000

500 ?, 適用蛋白分子量范圍15,000 ~ 5,000,000

1000 ?, 適用蛋白分子量范圍50,000 ~ 7,500,000

2000 ?, 適用蛋白分子量范圍>10,000,000

穩(wěn)定性和性能

SRT-C SEC柱使用的是被******覆蓋的鍵合硅膠填料，因此具有******的穩(wěn)定性。它與大多數(shù)緩沖液相容，如醋酸銨、磷酸鹽、Tris等。在pH 7.0，流動(dòng)相為150 mM磷酸鹽緩沖液環(huán)境下，對(duì)SRT-C SEC柱進(jìn)樣100次或使用1個(gè)月，其分離性能幾乎沒(méi)有發(fā)生改變。

    SRT-C SEC固定相具有中性、親水的特點(diǎn)，與生物分子特別是蛋白質(zhì)之間的非特異性相互作用非常小。SRT-C SEC柱還具有高容量的特點(diǎn)，因此能******高的分離效率和回收率。圖1是蛋白混合樣在7.8′300 mm SRT-C SEC-300柱上的分離色譜圖。

安全注意事項(xiàng)

SRT-C SEC柱通常在中壓下運(yùn)行。如果管路連接不緊，將會(huì)導(dǎo)致有機(jī)溶劑和注入樣品的泄漏，從而對(duì)操作人員的健康產(chǎn)生影響。一旦發(fā)生泄漏，應(yīng)佩戴適當(dāng)?shù)氖痔走M(jìn)行處理。另外當(dāng)打開(kāi)色譜柱時(shí)還應(yīng)采取適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)措施，以防止微小的硅膠顆粒進(jìn)入呼吸道。

色譜柱安裝與操作

色譜柱在運(yùn)輸過(guò)程中或在沒(méi)有使用時(shí)，它的兩端總是用堵頭進(jìn)行密封。當(dāng)將色譜柱接入色譜儀器系統(tǒng)時(shí)，首先移去兩端的堵頭。請(qǐng)注意將流動(dòng)相流動(dòng)的方向與柱上標(biāo)記的方向保持一致。除非出于特殊考慮，例如為了清除堵在色譜柱入口端的臟污等而需要將色譜柱反接以進(jìn)行沖洗時(shí)，建議用戶(hù)在接上色譜柱時(shí)一定要遵循柱上標(biāo)記的方向。由于色譜柱的連接是整個(gè)色譜操作過(guò)程的一部分，如果密封卡套過(guò)緊，或安裝不合適，或者密封卡套與色譜柱端口不匹配，都有可能導(dǎo)致溶液的泄漏。請(qǐng)按照下面步驟將色譜柱與密封卡套相連接，從而將色譜柱接入HPLC系統(tǒng)：

（a）******使用的管線(xiàn)，請(qǐng)依次將管線(xiàn)接頭和密封卡套裝在外徑1/16”的管線(xiàn)上。密封卡套的寬口端應(yīng)朝向管線(xiàn)接頭。

（b）將管線(xiàn)緊緊插入色譜柱的接口，向前滑動(dòng)密封卡套和管線(xiàn)接頭，并使管線(xiàn)接頭的螺紋與色譜柱端口的螺紋相互銜接，然后擰緊管線(xiàn)接頭。如果管線(xiàn)為高分子材料，請(qǐng)轉(zhuǎn)到步驟（d）；如果是金屬管線(xiàn)，請(qǐng)繼續(xù)（c）。

（c）在用力將管線(xiàn)壓入柱端接口之后，用1/4”扳手將已擰緊的螺帽再進(jìn)一步緊固。

（d）對(duì)色譜柱的另一端采用上述方法進(jìn)行操作。

樣品與流動(dòng)相

為了避免色譜柱的堵塞，所有樣品和溶劑，包括緩沖溶液在內(nèi)，都必須在使用前用0.45mm或0.2mm的濾膜過(guò)濾。SRT-C SEC柱可以使用水或有機(jī)溶劑和水的混合物，如甲醇（或乙腈）的水溶液等作為流動(dòng)相。流動(dòng)相在使用前需要脫氣。一個(gè)簡(jiǎn)單的脫氣方法是將流動(dòng)相在由水泵形成的真空下超聲5min。

色譜柱的保養(yǎng)

運(yùn)輸溶劑  新的SRT-C SEC柱中的液相是含0.05%NaN₃的0.1M磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）。在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中，硅膠填料可能會(huì)干涸。這時(shí)推薦用10-20倍柱體積的0.1M磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）進(jìn)行沖洗以活化色譜柱。接著可用用戶(hù)自己選擇的流動(dòng)相沖洗色譜柱。流速由0.1mL/min逐漸升至所需的操作條件，直至基線(xiàn)穩(wěn)定為止。如果柱壓和基線(xiàn)波動(dòng)較大，這可能是氣泡進(jìn)入了色譜柱中。這時(shí)可用較高流速?zèng)_洗色譜柱2-5分鐘，例如對(duì)于4.6′300mm的色譜柱可采用流速0.5mL/min。

pH   為了獲得優(yōu)良的分離效果和延長(zhǎng)柱的使用壽命，請(qǐng)盡量使用pH在2-8.5范圍內(nèi)的流動(dòng)相。

 

壓力  盡管SRT-C SEC柱可在高至3500psi的壓力下使用，但正常的操作壓力應(yīng)當(dāng)?shù)陀?000psi。長(zhǎng)時(shí)間在高壓下運(yùn)行會(huì)損壞色譜柱和輸液泵。由于壓力來(lái)源于流速，因此大流速將受制于系統(tǒng)所能承受的壓力。一般而言，柱壓會(huì)隨著色譜柱使用時(shí)間的增加而逐漸增加。壓力突然增加預(yù)示色譜柱入口端的篩板發(fā)生了堵塞。在這種情況下，建議將色譜柱反接后用適宜的溶劑進(jìn)行沖洗。

溫度  操作溫度為80°C。為了獲得長(zhǎng)的使用時(shí)間，操作溫度為10-30°C。長(zhǎng)時(shí)間在高溫（>80°C）下操作也會(huì)損壞色譜柱，這種情形在高的pH（>8）條件下特別突出。

流速范圍  內(nèi)徑為4.6mm和7.8mm的色譜柱，其正常操作流速分別為0.1-0.4和0.1-1.25mL/min。

 

儲(chǔ)藏  長(zhǎng)期不用時(shí)，需要將色譜柱貯存在0.05%NaN₃或20%

乙醇的流動(dòng)相中。每根色譜柱在運(yùn)輸過(guò)程中均會(huì)附有兩個(gè)可拆卸的堵頭。為了防止柱床干涸，請(qǐng)用堵頭塞緊色譜柱的兩端。

清洗  多次使用后某些樣品可能會(huì)吸附到入口篩板或填料上。當(dāng)積累至一定程度時(shí)會(huì)出現(xiàn)壓力升高并伴隨峰形展寬的現(xiàn)象。出現(xiàn)這種情況需要清洗色譜柱，一般清洗流程如下：

1. 將色譜柱與檢測(cè)器斷開(kāi)；

2. 將色譜柱反接后進(jìn)行沖洗；

3. 在低于50%推薦流速的條件下沖洗色譜柱。注意柱壓的變化。如果柱壓超出正常水平許多，可降低流速或更換低粘度的緩沖液作為沖洗溶劑；

4. 一般用清洗溶液沖洗10-15倍柱體積即可。更換溶液時(shí)請(qǐng)用3-5倍柱體積的經(jīng)過(guò)蒸餾的去離子水將色譜柱沖洗干凈。

清洗溶液  這里介紹清洗溶液選擇的基本原則。低pH的鹽溶液有助于移除堿性蛋白。有機(jī)溶劑有助于移除疏水蛋白。助溶劑有助于去除在固定相上強(qiáng)吸附的物質(zhì)（如通過(guò)氫鍵作用等）。應(yīng)注意只有在中性鹽溶液或有機(jī)溶劑沒(méi)有明顯改善效果的情況下使用助溶劑。這里推薦兩種常用的清洗溶液：

1. 具有低pH值的高濃度中性鹽溶液（如0.5 M*溶液，pH 3.0）。

2. 含有機(jī)溶劑（如10-20%的甲醇、乙腈、乙醇等）的緩沖溶液（如50 mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）。

色譜柱的保護(hù)

除了需要過(guò)濾樣品和流動(dòng)相外，保護(hù)色譜柱的方法是在色譜柱前連接保護(hù)柱或預(yù)柱濾片。預(yù)柱濾片可以去除樣品或流動(dòng)相中的殘留顆粒，或者從HPLC系統(tǒng)，如泵或進(jìn)樣器墊圈上脫離下來(lái)的顆粒。更為有效的方法是使用保護(hù)柱，因?yàn)樗梢猿悠?、流?dòng)相或者來(lái)自于HPLC系統(tǒng)中的具有強(qiáng)吸附能力的樣品組分和殘留顆粒。