測(cè)定食物中氨基酸含量一般采用氨基酸分析儀，柱后衍生測(cè)定。但氨基酸分析儀價(jià)格昂貴，分析時(shí)間長(zhǎng)，且只能用于分析氨基酸，限制了氨基酸分析技術(shù)的廣泛應(yīng)用。七十年代以來(lái)，柱前衍生高效液相色譜法開(kāi)始應(yīng)用于氨基酸的測(cè)定。液相色譜通用性強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度高,可用于多種物質(zhì)的分析。

濟(jì)南魯瑞科學(xué)儀器有限公司所采用柱前衍生紫外檢測(cè)的方法對(duì)幾種食物中的16種氨基酸進(jìn)行了測(cè)定。

方法

1、試劑

濃鹽酸（優(yōu)級(jí)純），（分析純），混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液，含17種蛋白水解氨基酸，天冬氨酸、、、、、、、、、、、擷氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、異、、苯，除濃度為1.25mmol/L外，其余16種氨基酸濃度各為2.5mmol/L流動(dòng)相A,磷酸鹽緩沖液用1：10雙蒸水稀釋?zhuān)琾H4.95。亦可自行配制，流動(dòng)相B：乙睛，流動(dòng)相C：雙蒸水,硼酸鹽緩沖液衍生試劑6一氨基喹琳基一N一羥基琥珀酞亞氨基甲酸酯，用時(shí)加入1mL乙睛,混勻于55℃烘箱加熱10min至溶解。

2、儀器
高效液相色譜儀

紫外檢測(cè)器

真空泵

超聲波清洗器

渦旋混合器

3、色譜條件色譜柱

色譜柱：高效C18色譜柱

柱溫：37℃

檢測(cè)波長(zhǎng)：248nm
進(jìn)樣量：10uL

梯度洗脫條件

4、實(shí)驗(yàn)方法

4.1衍生反應(yīng)

衍生試劑（AQC）與氨基酸迅速反應(yīng)生成在248nm有紫外吸收的高穩(wěn)定性的脲和羥基琥珀酰亞胺（NHS），過(guò)量的試劑可在慢反應(yīng)中水解，過(guò)程如下

4.2氨基酸衍生步驟
用微量注射器移取10uL稀釋的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液或樣品水解液放人6 (50mm樣品
管底部加人70uL硼酸鹽緩沖液,渦旋混合10s)，邊渦旋混合邊加入20uL衍生試劑溶液，用封口膜密封樣品管,置于55℃烘箱中加熱10min，從烘箱中取出樣品管冷卻至室溫,供分析用。此衍生樣品于4℃保存兩周。

4.3樣品水解
精密稱(chēng)取適量樣品約0.5-1.0g于水解管中,加入6mol/L鹽酸10-15ml，加入少量新蒸餾的，抽真空，充高純氮?dú)?，重?fù)3次。迅速將已充好氮?dú)獾乃夤軘Q緊蓋子，放入110℃烘箱中水解22h。水解完畢，將水解液過(guò)濾，定容。取適量，于55℃減壓干燥至干，再用適量二次蒸餾水復(fù)溶，備用。
工作曲線制作將氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液配制成濃度分100,200,400,600,800,1000umol/L的溶液，每一標(biāo)準(zhǔn)液取10uL依上法衍生后進(jìn)行測(cè)定。

4.4結(jié)果與討論
回歸方程根據(jù)工作曲線，以峰面積（A）與濃度（C）進(jìn)行回歸分析，回歸方程結(jié)果見(jiàn)表2。各氨基酸的檢測(cè)限為0.54umol/L

結(jié)果：

優(yōu)化了衍生試劑用量、衍生時(shí)間、緩沖鹽濃度以及pH值和柱溫等影響因素，最終在40 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了18種氨基酸的分離。

結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度好，可用于注射液中氨基酸的含量測(cè)定。