畢赤酵母宿主蛋白（HCP）殘留檢測試劑盒

（貨號：PH-E0021-1）

一、背景介紹

畢赤酵母宿主蛋白（HCP）殘留檢測試劑盒,本試劑盒是用來定量分析以畢赤酵母（Pichia Yeast）為表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，蛋白藥物中宿主細(xì) 胞殘留蛋白。 畢赤酵母作為常用的表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)目的蛋白的同時(shí)，會(huì)伴隨著表達(dá)細(xì)胞自身凋亡，資 料顯示細(xì)胞破碎后釋放到培養(yǎng)基中的宿主蛋白達(dá)上千種之多，其中很大一部分具有很強(qiáng)的免 疫原性，導(dǎo)致不良的毒性或免疫反應(yīng)而危及產(chǎn)品安全和質(zhì)量，造成潛在的生物污染，生物醫(yī) 藥產(chǎn)品生產(chǎn)下游過程的目的之一就是移除這些潛在危害。 因此，非常有必要將宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留量降低到最di水平，在研發(fā)下游純化的 工藝時(shí)，必須具有一種科學(xué)合理的測定成品或者半成品中 HCP 濃度的方法，而酶聯(lián)免疫法具 有高靈敏度，因而被監(jiān)管機(jī)構(gòu)定為 HCP 檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。

二、實(shí)驗(yàn)原理 

本試劑盒采用了固相夾心法的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）。先將捕獲抗體包被微孔板， 制成固相抗體。檢測時(shí)在包被抗體的微孔板中先加入待測抗原孵育，洗滌后加入辣根過氧化 物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體，形成包被抗體-抗原-檢測抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后去除未參與反 應(yīng)的結(jié)合物，最后加入底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 的氧化作用下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作 用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。氧化后的 TMB 顏色和因子的總含量呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），與濃度擬合成標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過樣本 OD 值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程， 計(jì)算樣品中因子濃度。

三、實(shí)驗(yàn)需要但試劑盒未提供的材料 

1) 10-1000μL 移液器及一次性滅菌吸頭 

2) 多道移液器

3) 滅菌的去離子水或超純水 1L

4) 滅菌 EP 管 

5) 吸水紙

6) 酶標(biāo)儀

7) 高速離心機(jī)

8) 迷你離心機(jī)

9) 洗板機(jī)或者洗瓶

10) 數(shù)據(jù)分析及繪圖軟件

四、樣本收集

培養(yǎng)基上清液：1000×g（或 3000rpm）離心 15 分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

樣本準(zhǔn)備注意事項(xiàng)： 

? 樣本收集完畢后，要分裝保存在-20℃(少于 3 個(gè)月) 或-80℃(少于 6 個(gè)月)以保持蛋白活性 和避免污染。避免反復(fù)凍融，如果要在 24 小時(shí)內(nèi)分析樣本，可以保存在 2- 8℃。 

? 某些化學(xué)裂解液可能會(huì)對本實(shí)驗(yàn)造成干擾，比如 SDS，Triton，謹(jǐn)慎使用。 

? 樣本液中含有沉淀物會(huì)對 ELISA 有干擾，務(wù)必離心去除。

? 不能加熱來融化樣本。