一、基本原理

酶聯(lián)免疫（ELISA）是免疫酶技術(shù)的一種，是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶反應(yīng)的敏感性相結(jié)合而建立的一種新技術(shù)ELISA的技術(shù)原理是：將酶分子與抗體（或抗原）結(jié)合，形成穩(wěn)定的酶標(biāo)抗體（或抗原）結(jié)合物，當(dāng)酶標(biāo)抗體（或抗原）與固相載體上的相應(yīng)抗原（或抗體）結(jié)合時(shí)，即可在底物溶液參與下，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的顏色反應(yīng)，顏色的深淺與抗原或抗體的量成比例關(guān)系，使用ELISA檢測(cè)儀，即酶標(biāo)儀，測(cè)定其吸收值可做出定量分析。此技術(shù)具有特異、敏感、結(jié)果判斷客觀、簡(jiǎn)便和安全等優(yōu)點(diǎn)，日益受到重視，不僅在微生物學(xué)中應(yīng)用廣，而且也被其他學(xué)科領(lǐng)域廣為采用。本試劑盒工作原理如下圖所示。

二、已配試劑

ELISA試劑盒中配備以下條目：

1、96孔已包被好的酶標(biāo)板

2、標(biāo)準(zhǔn)1：0.1 ng/mL的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液

3、標(biāo)準(zhǔn)2：0.2 ng/mL的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液

4、標(biāo)準(zhǔn)3：0.5 ng/mL的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液

5、標(biāo)準(zhǔn)4：1 ng/mL的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液

6、標(biāo)準(zhǔn)5：2 ng/mL的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液

7、1瓶溶液1 （單抗）

8、1只溶液2 (此溶液僅為二抗稀釋所用，并非二抗溶液，請(qǐng)按稀釋比例量??！)

9、二抗（小管內(nèi)含2.4 μL酶標(biāo)二抗，4℃保存）。

10、1瓶溶液3（底物溶液）

11、1瓶溶液4 （終止液）

12、1袋固體PBS（配置洗滌液用）

13、1只Tween 20 （配置洗滌液用）

三、操作步驟

1、分別吸取50 μL毒素標(biāo)準(zhǔn)品或樣品與對(duì)應(yīng)的孔中（參照表1），然后吸取50 μL單克隆抗體（溶液1）加入每孔中，輕輕混勻。37oC或室溫放置90分鐘。注意：必須先加標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，再加單克隆抗體溶液。

2、洗板

在水池邊快速甩出酶標(biāo)板中的液體。用吸管吸取洗滌液，加入板孔中，洗滌液量以加滿(mǎn)但不溢出板孔為宜。甩出洗滌液，再加洗滌液，重復(fù)上述操作三次，每次操作3分鐘。在濾紙上拍干。若有洗板機(jī)，可直接在洗板機(jī)上操作。

注意：切忌溢出互混！

3、每孔加入100 μL酶標(biāo)二抗稀釋液，37oC或室溫放置30分鐘。

4、洗板

同2方法，此步驟必須洗滌五次，每次3分鐘。

5、加底物溶液3

立即用排槍或吸管吸取此種溶液，分別加于板孔中，每孔100 μL，置37oC或室溫顯色，經(jīng)常觀察，顯色時(shí)間不超過(guò)30分鐘。

6、終止反應(yīng)

有明顯顏色顯示后，立即加50 μL 溶液4 1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。

7、判斷結(jié)果

肉眼觀察（白色背景），陰性對(duì)照孔應(yīng)明顯黃色。

測(cè)光密度，酶標(biāo)儀取λ=450 nm。注意：加終止液后，30分鐘以?xún)?nèi)檢測(cè)。

注意：滴加試劑量要準(zhǔn)，且試劑不可從一孔流到另一孔中，每種試劑對(duì)應(yīng)一種吸管（或槍頭），不能混淆。