【儀表網 研發(fā)快訊】華中科技大學袁菁教授、海南大學駱清銘院士團隊發(fā)明了一種數(shù)字陣列調制顯微鏡(DaMo)，實現(xiàn)橫向分辨率100 nm，軸向分辨率300 nm的無偽影、高質量、高通量三維超分辨成像。該方法照明調制對比度拉至100%，圖像保真度達到99±1%，重建速度提升了100倍，信背比提升了3個數(shù)量級。3月26日，研究成果以 “Threedimensional superresolution imaging with suppressed background via digital array modulation microscopy”為題發(fā)表在Nature Photonics上。
 

　　武漢光電國家研究中心李思潔博士生與金銳博士為并列第一作者，袁菁教授與駱清銘院士為并列通訊作者。魯夢琦碩士生、張朦博士、魏云飛博士、張湛博士生、郭詩睿博士生、張玉慧教授、龔輝教授以及陸軍軍醫(yī)大學張寧博士、王鋒超教授為共同作者。
 

　　光學顯微鏡自誕生以來，一直是生命科學研究的重要工具。然而，衍射極限長久以來如同“緊箍咒”，束縛著科學家對納米尺度世界的探索。超分辨成像技術的出現(xiàn)打破了這一桎梏，其中超分辨結構光照明顯微鏡(SR-SIM)憑借其優(yōu)異的標記兼容性，成為解析細胞器變化機制的利器。SR-SIM的核心思路是利用結構化照明對熒光信號進行調制，借助莫爾效應將樣品中原本不可見的高頻細節(jié)信息搬移到顯微鏡能夠探測到的范圍內，再通過Wiener重建算法還原出一張分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡提升一倍的超分辨圖像。
 

　　然而，自2000年問世以來，SR-SIM在重建圖像時易產生偽影、保真度不高的問題便如影隨形，成為該技術領域久攻不下的核心痛點。造成這一問題的根本原因在于，傳統(tǒng)方法采用的寬場成像光路在面對存在強烈背景干擾的非理想生物樣本時，很難有效抵抗噪聲和離焦背景的干擾。離焦背景與噪聲的存在，在頻域重建過程中易被放大，引入嚴重的重建偽影，損害圖像真實度與分辨率。現(xiàn)有方案多依賴于復雜的數(shù)據后處理來彌補這一缺陷，但這種“先污染后治理”的思路無法從根本上消除重建偽影來源，反而使計算流程變得復雜冗長，且后處理帶來的改善往往有限，甚至可能引入不真實的圖像特征，嚴重限制了其在復雜生物樣本中的廣泛應用。
 

　　研究團隊在前期工作中建立了一種全新的離軸成像框架。不同于傳統(tǒng)落射式照明成像中照明軸與探測軸共軸的方式，離軸成像框架采用照明與探測軸分離的成像策略。在該框架下，聚焦光斑形成天然的照明調制，陣列探測器捕獲其完整的空間分布，在像素層面建立起一一對應的關系。由此，每個探測器像素都與一個特定的照明子區(qū)域形成共軛，以固有的離軸方式記錄其獨特調制的信號。在掃描成像過程中，樣本點依次通過各照明子區(qū)域，使得單次掃描即可獲取時間復用且空間編碼的原始數(shù)據集，直接支撐了新型成像方法的靈活開發(fā)。DaMo正是這一框架下的集大成之作。
 

　　DaMo徹底跳出了傳統(tǒng)SR-SIM的固有范式，通過對天然高斯照明疊加虛擬陣列調制，將正弦調制的對比度提升至100%，并基于厄米特對稱性提出了單頻譜重建算法，將重建速度提升兩個數(shù)量級，信背比提升3個數(shù)量級，實現(xiàn)了橫向100納米、軸向300納米的三維分辨率。
 

　　核心創(chuàng)新亮點：第一，調制對比度提升至100%，從源頭消除了重建偽影。傳統(tǒng)SR-SIM采用零差探測成像，直接記錄正弦調制的熒光圖像，調制對比度的理論上限僅為50%，在實際應用中還極易受噪聲和背景干擾而進一步下降。DaMo利用線照明的天然高斯分布，結合陣列探測器的數(shù)字調制，實現(xiàn)了無需物理器件的100%高頻對比度外差探測成像。該設計將能量最大化分配至高頻分量，同時借助線照明的共聚焦效應，從物理底層有效抑制了離焦背景，徹底解決了傳統(tǒng)方法因噪聲和背景干擾而產生的重建偽影問題。第二，重建算法極致簡化，保真度達99%，計算速度提升兩個數(shù)量級。傳統(tǒng)SR-SIM采用全頻譜重建，計算過程復雜且耗時。DaMo獨創(chuàng)的單頻譜重建算法，首次利用厄米特對稱性將原本復雜的重建過程簡化為線性計算，同時僅使用高級次頻譜參與重建，進一步增強了對背景干擾的抑制效果。該算法不僅使重建速度提升兩個數(shù)量級，能夠在成像的同時完成圖像重建，更實現(xiàn)了99±1%的圖像保真度，確保了成像結果的真實可靠。得益于上述技術創(chuàng)新，DaMo僅憑橫向調制便同時打破了橫向和軸向的衍射極限，無需任何計算增強處理，即為復雜生物體系的觀測提供了真正無偽影、高質量、高通量的三維超分辨成像手段。
 

　　DaMo的顛覆性不止于技術參數(shù)，更在于其強大的生物學應用潛力。研究團隊通過一系列實驗，充分展示了這一新方法的獨特價值。
 

　　活細胞中肌動蛋白的超分辨成像一直頗具挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)方法難以將微弱的肌動蛋白信號與噪聲分離。得益于其超高的圖像質量，DaMo成功實現(xiàn)了對U2OS活細胞中肌動蛋白的時序記錄，首次觀察到絲狀偽足延伸并級聯(lián)融合的動態(tài)過程。這些結果充分展現(xiàn)了DaMo解析關鍵細胞過程中肌動蛋白時空動態(tài)的能力。此外，DaMo還具有較低的光毒性，在連續(xù)拍攝千余幀后細胞仍能保持活性。
 

　　傳統(tǒng)細胞器動態(tài)研究多依賴單細胞長時程觀察，需在形態(tài)細節(jié)與群體統(tǒng)計效力之間權衡，存在采樣廣度、時間穩(wěn)定性及實驗成本等方面的局限。為此，該研究提出了一種全新的高內涵分析途徑，通過對非同步化細胞進行全涂片快照式成像，無差別地獲取各階段具有統(tǒng)計學意義的形態(tài)學特征，從而實現(xiàn)高效的周期分析。DaMo用20分鐘完成了全涂片萬余個U2OS細胞的三色超分辨成像與同步重建，清晰揭示了從紡錘體形成、染色體分離到新細胞形成的完整有絲分裂過程。
 

　　組織切片的背景噪聲更強，整體空間異質性更復雜，對傳統(tǒng)超分辨成像技術構成了較大挑戰(zhàn)。而DaMo憑借其高質量、高通量的特性，有效突破了這一瓶頸。該工作展示了DaMo對10毫米見方小鼠小腸完整冰凍切片的三通道超分辨成像結果，實現(xiàn)了1.92 TB原始數(shù)據的高效采集與在線重建。在此基礎上，該工作還對小鼠小腸炎癥模型下不同腸段、不同部位的線粒體病變進行了定量統(tǒng)計與分析，充分展現(xiàn)了DaMo在組織水平實現(xiàn)跨尺度、高保真超分辨成像的獨特優(yōu)勢。
 

　　DaMo的問世，為超分辨成像領域提供了一種兼顧分辨率、通量、信背比與普適性的三維成像新范式。它以軟硬件協(xié)同優(yōu)化為核心，實現(xiàn)了無需復雜調制器件、無需圖像后處理增強的純凈成像路徑，打通了從亞細胞器到組織架構的跨尺度觀測鏈路。無論是活細胞、全細胞涂片，還是完整組織切片，該方法都展現(xiàn)出了出色的成像能力。這為生物醫(yī)學基礎研究與臨床診斷帶來了全新的可能，也讓高內涵超分辨成像分析有望在更多科學議題中大顯身手。