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抗體純化后,一般將其緩沖液置換成PBS,便于后期標(biāo)記或其他用途使用,如果濃度太低,需要濃縮,抗體濃縮后濃度最好不要太高,太高容易引起沉淀。
透析濃縮方法:
1.透析袋濃縮
將純化的抗體裝入透析袋中,透析袋表面覆滿PEG20,000進(jìn)行濃縮(不要用蔗糖濃縮)。
2.超濾管濃縮
將純化的抗體轉(zhuǎn)入15 ml的超濾管,3,500rpm離心12min左右(根據(jù)要濃縮的體積摸索離心時間)。
3.抗體濃度測定
取適量抗體檢測OD280nm的吸光度,讀數(shù)不要超過2。如果讀數(shù)超過2,再稀釋,用吸光度讀數(shù)除以1.35,再乘以稀釋倍數(shù)即為抗體的大致濃度(mg/ml)??贵w的濃度(mg/ml)也可以用(OD280nm-0.35×OD495nm)/1.4這個公式計算。
抗體的保存:
抗體的保存需要注意以下幾個方面:
1.純化完的抗體推薦于PBS或者TBS溶液保存,可添加0.1%疊氮化 Na防腐劑,但是疊氮化Na可能對下游實驗中的辣根過氧化物酶產(chǎn)生抑制作用,作為免疫檢測試劑開發(fā)的抗體一般使用有機(jī)化合物高分子防腐劑,避免對下游酶或者熒光染料的影響,如有需要可聯(lián)系福因德生物。
2.分裝成小管,避免污染或者反復(fù)凍融,溶解時需要緩慢解凍,不可直接放熱水急速解凍。
3.存放抗體容器不要選擇聚苯乙烯材料,可以選擇玻璃或者對蛋白低吸附材料的管子。
4.如果抗體要進(jìn)行后期標(biāo)記,最好在PBS中保存,不加防腐劑,短期內(nèi)使用可放4,長期存放-20保存。
5.如果抗體只做免疫學(xué)實驗,不進(jìn)行標(biāo)記可以添加保護(hù)劑(1% BSA或海藻糖),還可以加30%~50%甘油,-20保存,此保存方法只適合下游直接使用(ELISA,IHC,WB),不適合對其進(jìn)行標(biāo)記開發(fā),但其在-20不結(jié)冰,對抗體效價保存較好,并且使用時也不用反復(fù)凍融。
6.凍干可以保存更長時間,但是同樣要加入很多輔料保護(hù)劑,如:海藻糖、BSA,加了保護(hù)劑后期開發(fā)較難;也可以直接不加輔料保護(hù),直接凍干,但效價損失大。
7.不管用何種方法保存,應(yīng)盡量分裝成小管便于以后使用,抗體管上明確記錄必要信息(名稱、編號、時間,效價、純化人等)并且要建立記錄文檔記錄更詳細(xì)的信息。
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