測定意義

磷脂酶A2（EC3.1.1.4）是磷脂sn-2位脂?；饷?，廣泛存在于動植物組織、細菌、細胞核分泌物中，參與脂肪消化，細胞信號傳遞、脂質(zhì)過氧化修復(fù)、宿主反應(yīng)等生理過程，在控制體內(nèi)磷脂類物質(zhì)平衡、調(diào)節(jié)機體新陳代謝、參與疾病的病理進程等方面發(fā)揮著及其重要的作用。

測定原理

磷脂酶A2作用于2-硫代十六酰乙基磷酸（HEPC）產(chǎn)生游離巰基，與DTNB反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，在412nm處有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀器

天平、超速冷凍離心機、研缽、可見分光光度計、微量石英比色皿。

實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1.        加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.        棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100μl（在使用前一小時內(nèi)配制），酶標板加上覆膜, 37℃反應(yīng)60分鐘。

3.        溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4.        每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100μl，酶標板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。

5.        溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

6.        依序每孔加底物溶液90μl，酶標板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.       依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.       用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進行檢測。

1、細胞或組織樣品的制備：

培養(yǎng)細胞：先收集細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。