測(cè)定意義

Hephaestin (HP)作為銅藍(lán)蛋白的同系物,是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞鐵氧化酶，HP屬亞鐵氧化酶家族成員,具有亞鐵氧化酶的活性,參與體內(nèi)鐵代謝。HP的表達(dá)可受鐵、銅及鋅等金屬離子的調(diào)節(jié)。HP催化Fe2+氧化生成Fe3+，在介導(dǎo)鐵的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中有重要作用。

測(cè)定原理：

HP催化Fe2+氧化為Fe3+，F(xiàn)e2+和ferrozine反應(yīng)顯色，在560 nm下有特征吸光值。通過(guò)測(cè)定Fe2+的減少速率可測(cè)得亞鐵氧化酶的活性。

自備用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

1、細(xì)胞或組織樣品的制備：

培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測(cè)樣品含量，如樣品濃度過(guò)高時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)允瓜♂尯蟮臉悠贩显噭┖械臋z測(cè)范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1.        加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.        棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100μl（在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜, 37℃反應(yīng)60分鐘。

3.        溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4.        每孔加檢測(cè)溶液B工作液（同檢測(cè)A工作液） 100μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。

5.        溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

6.        依序每孔加底物溶液90μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.       依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.       用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進(jìn)行檢測(cè)。