本試劑盒適用于培養(yǎng)細(xì)胞及新鮮組織caspase-3 檢測(cè)。Caspase 家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3 為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，與DNA 斷裂、染色質(zhì)凝聚和凋亡小體形成有關(guān)。Caspase-3 在正常狀態(tài)下以酶原的形式存在于胞漿中，沒有活性；但在細(xì)胞發(fā)生凋亡階段，它被激活，活化的Caspase-3 由兩個(gè)大亞基和兩個(gè)小亞基組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase-3 分光光度法檢測(cè)試劑盒就是將caspase-3 序列特異性的多肽偶聯(lián)至發(fā)色基團(tuán)。當(dāng)該底物被Caspase-3 剪切后，發(fā)色基團(tuán)即游離出來，可通過酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)（λ=405nm或400nm）測(cè)定其吸光值，考察caspase-3 的活化程度。

注意事項(xiàng)

1. Caspase-3 Substrate 避光保存及使用。

2. 對(duì)某些凋亡誘導(dǎo)劑引起的細(xì)胞凋亡可能存在非依賴于Caspase-3 活化的機(jī)制，這種情況時(shí)利用本試劑盒檢測(cè)Caspase-3 活性無明顯改變，需要考慮凋亡機(jī)制中的其他信號(hào)通路。

3. 細(xì)胞數(shù)量需達(dá)到3~5×106 個(gè)或新鮮組織50~100mg，以便能達(dá)到測(cè)定需要的100~200μg 蛋白的要求，因?yàn)镃aspase-3 的活性與細(xì)胞裂解液的蛋白含量有關(guān)，如測(cè)定的OD 值偏低，可通過增加細(xì)胞數(shù)量或組織量的方法來提高蛋白量。

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。