測定意義

土壤磷酸酶是一類催化土壤有機(jī)磷化合物礦化的酶，其活性的高低直接影響著土壤中有機(jī)磷的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性，是評價土壤磷素生物轉(zhuǎn)化方向與強(qiáng)度的指標(biāo)。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH顯著影響。通常按照其最適pH范圍，分為堿性、中性和酸性三種類型磷酸酶。

測定原理：

堿性環(huán)境中，S-AKP/ALP催化磷酸苯二鈉水解生成苯和磷酸氫二，通過測定酚的生成量即可計算出S-AKP/ALP活性。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、臺式離心機(jī)、37℃恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、冰、蒸餾水、無水乙醇和甲苯。

實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1.        加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.        棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100μl（在使用前一小時內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜, 37℃反應(yīng)60分鐘。

3.        溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4.        每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。

5.        溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

6.        依序每孔加底物溶液90μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.       依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.       用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進(jìn)行檢測。

1、細(xì)胞或組織樣品的制備：

培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。