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貨號	FS-X10938

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

中文名稱：FRAX486是group I PAKs有效抑制劑

英文名稱：FRAX486

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg

貨號：FS-X10938

產(chǎn)品介紹:

FRAX486是group I PAKs有效選擇性抑制劑，對PAK1、PAK2和PAK3的IC50值分別為8.25nM、39.5nM和55.3nM，對PAK4的抑制力弱（IC50=779nM）。

注：本品僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他用途！

號：1232030-35-1

純度：98.0%

分子量：513.39

儲存條件：-20℃，有效期2年，溶入溶劑后-20℃請盡量在一個月內(nèi)使用。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

洋蔥伯克霍爾德菌人水通道蛋白2Paenibacillus mucilaginosus小鼠胰島樣生長因子結(jié)合蛋白1(IGFBP-1)

紫皮麗菇人水通道蛋白1Bacillus mycoides小鼠胰島樣生長因子結(jié)合蛋白2(IGFBP-2)

豬鏈球菌分型血清參考品血清型 SS12人水通道蛋白0Bacillus mycoides小鼠胰島樣生長因子結(jié)合蛋白2(IGFBP-2)

釀酒酵母人類風(fēng)濕因子Bacillus mycoides小鼠白介16(IL-16)

桑樹枝枯病人抗鏈球菌溶血O/抗OBacillus mycoides小鼠白介16(IL-16)

拜耳接合酵母人腎上腺皮質(zhì)抗體Bacillus mycoides小鼠白介3(IL-3)

鏈格孢人抗腎小球基底膜抗體Bacillus mycoides小鼠白介3(IL-3)

熒光假單胞菌人β2微球蛋白Bacillus mycoides小鼠白介4(IL-4)

枯草芽孢桿菌人膜聯(lián)蛋白ⅤBacillus mycoides小鼠白介4(IL-4)

毛栓菌人抗腎小管基底膜抗體Bacillus niacini小鼠白介-5(IL-5)

橄欖灰鏈霉菌人apelin 13Bacillus oleronius小鼠白介-5(IL-5)

根霉人Apelin 36Bacillus pseudofirmus小鼠層連蛋白/板層(LN)

新月彎孢人肌鈣蛋白TBacillus pseudofirmus小鼠層連蛋白/板層(LN)

巴氏醋桿菌人血管內(nèi)皮抑抗體Bacillus pseudofirmus小鼠巨噬集落激因子(M-CSF)

奇異球菌屬人血管緊張Ⅱ受體Ⅰa型Sporosarcina psychrophila小鼠巨噬集落激因子(M-CSF)

球孢白僵菌人血管生成樣蛋白3Bacillus psychrosaccharolytic小鼠巨噬來源的趨化因子(MDC/CCL22)

鋅指蛋白263抗體梨干枯擬莖點菌大鼠心肌細(xì)胞

鋅指蛋白195抗體丁香絲膜菌人的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞

鋅指蛋白266抗體栓黑管菌小鼠腎足細(xì)胞

鋅指蛋白786抗體稻平臍蠕孢(斜面)人支氣管上皮細(xì)胞
FRAX486是group I PAKs有效抑制劑釀酒酵母碳錳胰島

凝結(jié)芽孢桿硫錳胰島樣生長因子1

擬莖點霉硬脂鈣胰島樣生長因子2

乳乳球霍氏亞種草鈣胰島樣生長因子結(jié)合蛋白-1

球蓋蟻巢傘乙鈣胰島樣生長因子結(jié)合蛋白-3

宇佐美曲霉無水硫鈣胰高血糖

Kocuria polaris 硫鈣乙酰CoA羧化

冬蟲夏草焦磷鈣乙酰CoA羧化α

金針菇磷三鈣乙酰CoA羧化β

枯草芽孢桿磷二氫鈣異檸檬脫氫

根瘤過磷鈣硬脂酰去飽和1

枯草芽孢桿枯草亞種氫氧化鈣游離膽固

硬水黃桿碳鈣孕酮

香草蘭根疾磷氫鈣脂蛋白脂

赤紅球二甲基亞砜脂肪甘油三酯脂
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)