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貨號	FS-X10823

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

中文名稱：c-Raf抑制劑(GW 5074)

英文名稱：GW 5074

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg

貨號：FS-X10823

產(chǎn)品介紹:

GW5074是一種有效的，選擇性的c-Raf抑制劑，IC50值為9nM；對JNK1/2/3，MEK1，MKK6/7，CDK1/2，c-Src，p38MAP，VEGFR2或c-Fms等沒有作用。

注：本品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他用途！

號：220904-83-6

純度：98.77%

分子量：520.94

儲存條件：-20℃，有效期2年，溶入溶劑后-20℃請盡量在一個(gè)月內(nèi)使用。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

枯草芽孢桿菌大鼠多巴D1受體Anti-OR51F1 Antibody人脾臟酪激(Syk)

發(fā)酵乳桿菌人胰島樣生長因子結(jié)合蛋白2Anti-OR51F2 Antibody人脾臟酪激(Syk)

圓芝6號人胰島樣生長因子結(jié)合蛋白1Anti-OR51G1 Antibody人絲/蘇蛋白磷(STK)

施氏假單胞菌大鼠腎上腺能a1A受體Anti-OR51G2 Antibody人絲/蘇蛋白磷(STK)

香氣紅冬孢鎖擲孢酵母小鼠白介16Anti-OR51G2 Antibody人白介受體相關(guān)激(IRAK)

大腸埃希氏菌小鼠白介3Anti-OR51H1 Antibody人白介受體相關(guān)激(IRAK)

馬腺疫鏈球菌獸疫亞種人胰島樣生長因子2Anti-OR51I1 Antibody人尿激(UK)

杉葉散斑殼大鼠鈣結(jié)合蛋白Anti-OR51Q1 Antibody人尿激(UK)

弓形蟲(GJS-2株)小鼠白介4Anti-OR51I2 Antibody人磷烯式羧激(PCK)

根瘤菌大鼠透明質(zhì)結(jié)合蛋白Anti-OR51I2 Antibody人磷烯式羧激(PCK)

三葉草根瘤菌人胰島樣生長因子1Anti-OR51S1 Antibody人(trypsin)

微小根毛霉人γ干擾Anti-OR51T1 Antibody人(trypsin)

大腸埃希氏桿菌大鼠骨形成蛋白6Anti-OR52A1 Antibody人β位淀粉樣前體蛋白裂解1（BACE1）

德氏乳桿菌保加利亞亞種小鼠白介5Anti-OR51T1 Antibody人β位淀粉樣前體蛋白裂解1（BACE1）

榛色假單胞菌小鼠層連蛋白/板層Anti-OR52A4P Antibody人蛋白二硫化物異構(gòu)前體(PDI)

芽孢桿菌屬人間粘附分子1Anti-OR52A4P Antibody人蛋白二硫化物異構(gòu)前體(PDI)

環(huán)指蛋白12抗體多根硬皮馬勃人肺腺癌 (胸水)

RAN結(jié)合蛋白1抗體#蟬花1-9人肺扁平上皮癌細(xì)胞

環(huán)指蛋白150抗體#蟬花人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞

RAN結(jié)合蛋白3抗體綠粘帚霉人胸膜瘤細(xì)胞
c-Raf抑制劑(GW 5074)威克克魯維酵母 1%吐溫80-玉瓊脂培養(yǎng)基抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基

膠孢梭增培養(yǎng)基5羥色

Pragia sp. 吡哆Y培養(yǎng)基活性氧簇

墳?zāi)构?jié)桿結(jié)晶紫中性紅膽鹽肉湯CED-3蛋白

黃色短桿 RNS培養(yǎng)基CED-9蛋白

解淀粉芽孢桿 APT肉湯一氧化氮合成

孟氏假單胞 MFB培養(yǎng)基熱休克蛋白70

釀酒酵母 BIGGY瓊脂水通道蛋白

長枝木霉 MEI培養(yǎng)基H2A組蛋白家族成員X

綠粘帚霉假單胞cfc選擇性培養(yǎng)基脂質(zhì)過氧化物

芽孢桿假單胞cfc選擇性培養(yǎng)基添加劑

白假絲酵母 STAA添加劑8羥基脫氧鳥

赤紅球葡萄糖（腦膜炎奈瑟氏）二

小單孢麥芽糖（腦膜炎奈瑟氏）海藻糖合成

鏈格孢乳糖（腦膜炎奈瑟氏）海藻糖合成
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)