揮發(fā)性脂肪酸的測(cè)定（一）氣相色譜測(cè)定法

時(shí)間：2022/11/19閱讀：2649

揮發(fā)性脂肪酸的測(cè)定

一般來(lái)說(shuō)，碳原子數(shù)在10以下的脂肪酸大部分具有揮發(fā)性，并且易溶于水。在它們中間，隨著碳原子數(shù)的增加，揮發(fā)性逐漸下降。典型的揮發(fā)酸見附表5。
附表5 低級(jí)脂肪酸的分子式及沸點(diǎn)

名稱	分子式	沸點(diǎn)/℃	名稱	分子式	沸點(diǎn)/℃
甲酸乙酸丙酸	HCOOH CH₃COOH C₂H₅COOH	100.8 117.5 140.0	丁酸戊酸已酸	C₃H₇COOH C₄H₉COOH C₅H₁₁COOH	162.3 185.5 205.0

揮發(fā)性脂肪酸易被微生物利用。在有機(jī)物的厭氧分解中，揮發(fā)性脂肪酸是作為生物代謝的中間或最終產(chǎn)物而存在。在厭氧發(fā)酵的液化產(chǎn)酸階段，這一類低級(jí)脂肪酸是這一階段的主要產(chǎn)物，其中以乙酸為主。在某種條件下，乙酸可以達(dá)到該類酸總量的80%。在CH4形成過(guò)程中，甲酸和乙酸是形成甲烷的重要前體物。據(jù)研究，自然界有機(jī)物產(chǎn)生的CH4中大約有70%上由乙酸中的甲基原子團(tuán)形成的。丙酸、丁酸可以轉(zhuǎn)化成甲酸。有機(jī)酸過(guò)多往往反映出發(fā)酵池的病態(tài)。因此可以認(rèn)為，在微生物厭氧發(fā)酵過(guò)程中，揮發(fā)性脂肪酸不僅是一種的營(yíng)養(yǎng)成分，更重要的意義在于這類有機(jī)酸已是沼氣發(fā)酵研究有機(jī)物降解工藝條件優(yōu)劣的重要參數(shù)，在甲烷形成的研究和生產(chǎn)中，它們的含量也是重要的參數(shù)。
在揮發(fā)性脂肪酸的總量測(cè)定中，是以乙酸作為基數(shù)進(jìn)行計(jì)算，除了要求測(cè)定總量外，對(duì)甲酸、乙酸等各種低級(jí)脂肪酸的分別定量分析也是十分重要的。

C2～C5揮發(fā)性脂肪酸的氣相色譜測(cè)定法

2.5.1.1 測(cè)定原理
使用色譜儀上的氫火焰檢測(cè)器測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸含量，其基本原理是：色譜柱分離后餾出的物質(zhì)被載氣載入檢測(cè)器離子室的噴嘴口，與燃燒氣—氫氣相混合，并以空氣助燃?xì)膺M(jìn)行燃燒，以此為能源，將組分電離成離子數(shù)目相等的正離子和負(fù)離子（電子）。在離子室內(nèi)裝有收集極和底電極，因此離子在電場(chǎng)內(nèi)作定向流動(dòng)，形成離子流。該離子流被收集極收集后，經(jīng)過(guò)微電流放大器放大輸送給記錄儀得到信號(hào)，此信號(hào)的大小代表單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測(cè)器火焰的組分含量。

1、測(cè)定條件

⑴試劑設(shè)備
① 乙酸、丙酸、丁酸、戊酸混合標(biāo)準(zhǔn)液的配制。分別吸取乙酸（A.R.，相對(duì)密度1.045，含量99%）、丙酸（A.R.，相對(duì)密度0.9987，含量99.5%）、丁酸（A.R.，相對(duì)密度0.8097，含量99%）、戊酸（A.R.，相對(duì)密度0.934，含量99%）各25μL于50mL容量瓶中，再加入2.5mL甲酸（A.R.，相對(duì)密度1.22，含量88%），最后用蒸餾水定容。其中乙酸、丁酸、戊酸的濃度分別為517μL/L、497μL/L、401μL/L、467μL/L。
② 6mol/ L硫酸的配制：將167mL濃硫酸（相對(duì)密度1.84）緩慢倒入833mL蒸餾水中。
③ 甲酸：相對(duì)密度1.22，含量88%。
④ 離心機(jī)4000～16000r/min。
⑤ 氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測(cè)器。
⑵ 樣品預(yù)處理用沼氣發(fā)酵液7mL加入2滴6mol/ L H₂SO₄使pH值降至3.5左右（用pH試紙粗測(cè)），離心20～30 min，取上層透明清液3mL，加入0.15 mL濃甲酸，最終pH值為2.0左右（控制在3.0以下）。
⑶ 主要實(shí)驗(yàn)參數(shù)
① 條件一。固定相：GDX₁₀₃+H₃PO₄，2%(60～80目)；色譜柱：2m×φ6mm；柱溫：180～200℃；氣化室溫度：240℃；檢測(cè)溫度：210℃；進(jìn)樣量：2μL；載氣流量：N₂，50mL/ min；氫氣流量：50 mL/ min；空氣流量：600～700 mL/ min；衰減：×1/8。
② 條件二。色譜柱：2m×φ3mm，不銹鋼柱，內(nèi)填國(guó)產(chǎn)GDX-401擔(dān)體，60～80目；柱溫：210℃；載氣：N₂，流率為90mL/ min；空氣流率：500 mL/ min；氫氣流率：50 mL/ min；氣化室溫度：240℃；檢測(cè)溫度：210℃。
③ 條件三。色譜柱：2m×φ6mm，裝有以2%磷酸飽和的60～80目GDX-103擔(dān)體；柱溫：180～200℃；氣化室溫度：240℃；檢測(cè)溫度：210℃；進(jìn)樣量：2μL；載氣流量：N₂，50mL/ min；氫氣流量：50 mL/ min；空氣流量：600～700 mL/ min；
④ 條件四。色譜柱：2m×φ2mm，玻璃柱，內(nèi)裝有10%的商品固定液FluoradFC431涂布的Supelcoport擔(dān)體，100～200目；柱溫：130℃；氣化室溫度：220℃；檢測(cè)溫度：210℃；載氣流量：N₂，40mL/ min。
⑷ 定性與定量
① 定性。配制模擬標(biāo)準(zhǔn)樣品，用已知物質(zhì)的保留時(shí)間對(duì)照被測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間進(jìn)行定性。
② 定量。用已知樣校正法進(jìn)行定量，其方法是配制已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣（與樣品組分一致），進(jìn)行色譜試驗(yàn)，測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)樣各組分的峰高（或峰面積），求出組分i的單位峰高（或峰面積）的組分含量或作出峰高和濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)樣品組分濃度變化不大時(shí)，可采用單位校正法。當(dāng)樣品組分濃度變化很大時(shí)，則需預(yù)先用校準(zhǔn)樣作出濃度和峰高或峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，觀察其標(biāo)準(zhǔn)曲線是不是通過(guò)原點(diǎn)的直線，即是否呈線性。若呈線性，就可用單點(diǎn)校正法，按下面的公式計(jì)算：

2、方法的精度和注意事項(xiàng)：

⑴ 以GDX₁₀₃+H₃PO₄2%為固定相，比用GDX₁₀₁、PEGS、Porapak.N等作為固定相其保留時(shí)間短，且峰形對(duì)稱。
⑵ 本法最小檢測(cè)量為4μL/L，相對(duì)誤差為1.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<2.7%（以乙酸計(jì)）。
⑶ 有機(jī)酸是一種強(qiáng)極性物質(zhì)，沸點(diǎn)較高，由于擔(dān)體對(duì)酸的吸附，常常引起酸峰拖尾和鬼峰的出現(xiàn)。因此，取有機(jī)酸直接進(jìn)樣測(cè)定時(shí)，為了抑制酸的吸附，可采取以下措施。
① 在樣品中加入一定量的濃甲酸（相對(duì)密度1.22，含量88%），使其甲酸加入量（體積）與樣品的體積比為5：100。甲酸是一種一元羧酸，離解常數(shù)（2.11×10^-4）大于其他任何一元羧酸，當(dāng)含有甲酸的樣品進(jìn)入固定相時(shí)，擔(dān)體表面的吸附中心位置被甲酸暫時(shí)占據(jù)，這樣便抑制了C₂～C₅酸被擔(dān)體的吸附。此外，甲酸在FID上響應(yīng)很低，故對(duì)其他組分的應(yīng)答影響不大。
② 酸的吸附還發(fā)生在接近進(jìn)樣口的地方，由于進(jìn)樣口常積累有碳質(zhì)沉積物，通常采用蒸餾水清洗進(jìn)樣口，并用1.5%磷酸-丙酮液來(lái)浸泡進(jìn)樣口，然后在約150℃的溫度下將進(jìn)樣口烘烤4～8h。
③ 用1.5%磷酸-丙酮液來(lái)浸泡柱口玻璃毛。
④ 在分析高濃度時(shí)，一定分析周期內(nèi)注射水或15%甲酸液來(lái)洗滌被柱子吸附的酸。
⑤ 操作條件恒定以后，在進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)酸樣或樣品之前，用15%的甲酸液來(lái)沖洗柱子3～4次。
⑷ 柱子使用壽命大約4～6個(gè)月，一旦發(fā)現(xiàn)色譜峰出現(xiàn)拖尾或重復(fù)性差，則必須更換柱。
⑸ 盡管采取了一系列防止吸附的措施，但柱子的吸附問(wèn)題還是不可能解決，特別是對(duì)于4000μL/L以上高濃度的酸樣，如何克服吸附問(wèn)題還值得更進(jìn)一步研究。
⑹ 當(dāng)檢測(cè)器的靈敏度顯著降低或更換新柱之后，重新做校正曲線。

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揮發(fā)性脂肪酸的測(cè)定（一）氣相色譜測(cè)定法

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