組份

數(shù)目

細胞

 1 T-25瓶

細胞說明書

一份

生長特性：

貼壁生長

細胞來源：

從ATCC/中科院/協(xié)和醫(yī)院等地引進

培yang條件：

培yang基：F12K+0.1mg/ml肝素+1%ECGS +10%FBS（*德國SERANA S-FBS-SA-015優(yōu)等胎牛血清）

氣相：空氣95%，二氧化碳5%

溫度：37℃

培yang：

• 貼壁細胞

1.用75%酒精噴灑整個瓶消毒，將其平躺置于培yang箱中進行2-3小時的緩沖，.然后置于無菌操作臺，打開瓶口，將其中的培yang液去掉，再往其中加入5-6mL新鮮培yang基并置于細胞培yang箱中培yang，根據(jù)細胞生長狀況及培yang基顏色變化對其進行換液以及傳代；

2.待細胞長滿瓶底面積80%-90%，需要對其進行傳代，*次傳代比例為1:2。

3傳代步驟：將0.25%含EDTA*置于37°預(yù)熱，倒掉培yang瓶中的培yang基，往培yang瓶中加入1mlPBS，輕晃洗滌后棄去。往瓶中加1ml預(yù)熱好的*，置于37°孵育消化（*次消化需時常取出置于顯微鏡下觀察，以顯微鏡下細胞觸角回收變圓、輕拍瓶壁見細胞脫落為zui佳消化時間，記錄zui佳消化時間，以便于下次消化），消化好后加入1ml*培yang基終止消化。用移液槍輕輕吹打瓶壁上的細胞，使之*脫落，然后收集細胞懸液，1200rpm離心3min，棄上清，加入*培yang基重懸細胞，進行傳代。

二、懸浮細胞

1.用75%酒精噴灑整個瓶消毒，然后置于無菌操作臺，打開瓶口，輕輕吹打后，將其中的細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，然后1200rpm離心3min，去上清；

2.將離心好的細胞轉(zhuǎn)移至T-25瓶中，并加入5-6mL新鮮培yang基，然后將其置于細胞培yang箱中培yang，根據(jù)細胞生長狀況及培yang基顏色變化對其進行換液（離心后去舊液，加入新鮮培yang基）；

3.顯微鏡觀察細胞數(shù)目比較多時，對其進行傳代，*次傳代比例為1:2（離心后平均分成兩瓶培yang）。

細胞總數(shù)：

1~3*10⁶

傳代周期：

2-3天

傳代比例：

1:2~1:4

換液頻率：

2-3天

凍存液：

90%FBS+10%DMSO

問題

原因

解決方案

細胞生長緩慢

生長培yang基使用不當(dāng)

按照生產(chǎn)商的建議，使用相應(yīng)的預(yù)熱生長培yang基。

生長培yang基中血清質(zhì)量差

使用其他批次血清。

傳代操作不當(dāng)

按照生產(chǎn)商的建議消化時間及傳代比例進行操作。

換液過于頻繁

降低換液頻率，參考生產(chǎn)商*的換液頻率。

細胞傳代次數(shù)過多

使用傳代次數(shù)較少的健康細胞。

細胞生長超過匯合狀態(tài)

哺乳動物細胞傳代應(yīng)在細胞處于對數(shù)期、未達到匯合狀態(tài)時進行，建議細胞密度達 80-90%傳代。

細胞被支原體污染

將細胞、培yang基和試劑丟棄；新取一只凍存細胞，并且使用新的培yang基和試劑。

細胞復(fù)蘇存活率低

細胞凍存不當(dāng)

新取一只凍存細胞，并儲存在液氮中。將細胞儲存在液氮中，直至復(fù)蘇。

自行制備的凍存細胞無活性

將細胞按照生產(chǎn)商*的密度凍存。

制備凍存細胞時使用傳代次數(shù)少的細胞。

嚴(yán)格按照生產(chǎn)商*的操作程序凍存細胞。請注意本手冊*的冷凍程序是凍存細胞的一般流程，只能作為指導(dǎo)原則使用。

新取一只凍存細胞。

細胞復(fù)蘇方法不當(dāng)

嚴(yán)格按照生產(chǎn)商*的操作程序復(fù)蘇細胞。請注意本手冊*的解凍程序是復(fù)蘇細胞的一般流程，只能作為指導(dǎo)原則使用。

確保冷凍細胞解凍迅速，接種前用預(yù)熱的生長培yang基緩慢稀釋細胞。

復(fù)蘇培yang基使用不當(dāng)

使用生產(chǎn)商*的培yang基。確保培yang基使用前已經(jīng)預(yù)熱。

細胞稀釋過度

按照生產(chǎn)商的建議，將解凍后的細胞高密度接種，以改善復(fù)蘇效果。

處理細胞時動作不夠輕柔

凍存和復(fù)蘇過程對大多數(shù)細胞都會造成不利影 響。不要通過渦旋振蕩或者用力敲打培yang瓶的方法使細胞脫落(培yang昆蟲細胞時除外)，也不要高速離心細胞。

凍存液中所用保護劑在儲存過程中未避光

如果未避光儲存，凍存保護劑會轉(zhuǎn)變?yōu)閷毎卸拘缘奈镔|(zhì)；新取一只凍存保護劑，重新凍存細胞。