一、技術(shù)介紹

在生物體內(nèi)，絕大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子并非單獨(dú)發(fā)揮作用，而是通過與自身蛋白、其他轉(zhuǎn)錄因子或其他蛋白形成同源/異源二聚體/多聚體復(fù)合物來行使功能。如何挖掘這類復(fù)合物關(guān)鍵調(diào)控因子，對(duì)解析細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要。目前，一個(gè)新技術(shù)——雙DNA親和純化測(cè)序的（dDAP-seq）出現(xiàn)，為這類研究提供了新的思路和手段。雙DNA親和純化測(cè)序（dDAP-seq）是在DNA親和純化測(cè)序（DAP-seq）技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)化而來，其核心原理為：通過體外共表達(dá)兩個(gè)帶有不同親和標(biāo)簽的轉(zhuǎn)錄因子，使其在體外形成異源二聚體，再與基因組DNA片段孵育結(jié)合，進(jìn)一步富集與目的蛋白結(jié)合的DNA，經(jīng)高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析，在全基因組范圍內(nèi)定位相互作用轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。將dDAP-seq與DAP-seq聯(lián)合應(yīng)用，還可系統(tǒng)分析單轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體DNA結(jié)合偏好特征與差異，為深入解析轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同互作、精細(xì)繪制基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了全新解決方案。

藍(lán)景科信dDAP-seq技術(shù)路線圖

二、藍(lán)景科信dDAP-seq技術(shù)驗(yàn)證

藍(lán)景科信基于dDAP-seq技術(shù)已經(jīng)完成多個(gè)客戶項(xiàng)目，積累了豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)。近期，藍(lán)景科信對(duì)已發(fā)表在《Nature Plants》的dDAP-seq數(shù)據(jù)[1]進(jìn)行了驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證明了公司自建流程的可靠性和準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示（如下圖），轉(zhuǎn)錄因子異源二聚體形成后，結(jié)合峰數(shù)量較單轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合峰數(shù)量顯著提升，且結(jié)合基序偏好發(fā)生了改變。該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道高度一致，且整體數(shù)據(jù)質(zhì)量比文章結(jié)果更優(yōu)。

圖1. DAP-seq與dDAP-seq數(shù)據(jù)集中檢測(cè)到的峰數(shù)量及主要基序分布

三、       dDAP-seq相關(guān)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)介紹

（一）       體外蛋白pull-down

在進(jìn)行dDAP-seq前，首先需要體外驗(yàn)證兩種轉(zhuǎn)錄因子或蛋白的直接物理互作，排除dDAP-seq結(jié)合信號(hào)的非特異性結(jié)合干擾，實(shí)驗(yàn)流程如下：

蛋白制備：分別純化獲得標(biāo)簽標(biāo)記誘餌蛋白與候選互作靶蛋白；

體外孵育：將誘餌蛋白與靶蛋白體外共孵育，同時(shí)設(shè)置空載標(biāo)簽蛋白作為陰性對(duì)照；

親和富集：利用親和樹脂捕獲誘餌蛋白及其結(jié)合的互作蛋白，洗脫富集復(fù)合物；

蛋白檢測(cè)：通過Western blot檢測(cè)各組結(jié)合產(chǎn)物中靶蛋白表達(dá)情況。

結(jié)果判定：單一蛋白組僅存在自身?xiàng)l帶，共孵育實(shí)驗(yàn)組可檢測(cè)到特異性互作條帶，空載對(duì)照組無特異性條帶。

結(jié)果示例[2]：

圖2. 蛋白pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使用SBP抗體，分別對(duì)SBP-bZIPS1和Halo-bZIPC 混合后（泳道標(biāo)注為Input）及經(jīng)Halo標(biāo)簽配體偶聯(lián)磁珠親和純化的產(chǎn)物（泳道標(biāo)注為IP）進(jìn)行檢測(cè)。以Halo標(biāo)簽空載體作為陰性對(duì)照。WB：蛋白質(zhì)印跡法；IP：免疫沉淀。

（二）凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）

該實(shí)驗(yàn)用于體外直接驗(yàn)證二聚體與靶DNA的特異性結(jié)合，并區(qū)分單體與復(fù)合物條帶，實(shí)驗(yàn)流程如下：

探針制備：合成并標(biāo)記包含dDAP-seq鑒定的結(jié)合位點(diǎn)的DNA探針；

蛋白孵育：分別制備單轉(zhuǎn)錄因子蛋白、兩種轉(zhuǎn)錄因子混合蛋白，與標(biāo)記探針體外孵育；

凝膠電泳：非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離游離探針與蛋白–DNA復(fù)合物；

結(jié)果判定：單轉(zhuǎn)錄因子組出現(xiàn)較快遷移條帶（單體結(jié)合），雙轉(zhuǎn)錄因子共表達(dá)組出現(xiàn)更慢遷移條帶（異源二聚體結(jié)合），條帶位置與單體組明顯區(qū)分；

結(jié)果示例：

圖3. EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Lane1：轉(zhuǎn)錄因子1+陽性探針；Lane2：轉(zhuǎn)錄因子2+陽性探針；Lane3：轉(zhuǎn)錄因子1和轉(zhuǎn)錄因子2復(fù)合體+陽性探針。

（三）雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證（Dual-LUC）

用于體內(nèi)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，量化協(xié)同調(diào)控效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)流程如下：

報(bào)告載體構(gòu)建：將dDAP-seq鑒定的靶基因啟動(dòng)子區(qū)插入熒光素酶報(bào)告載體；

效應(yīng)載體共轉(zhuǎn)染：將兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體與報(bào)告載體、內(nèi)參載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞；

分組設(shè)置：設(shè)置空載體對(duì)照、單轉(zhuǎn)錄因子組、雙轉(zhuǎn)錄因子共轉(zhuǎn)組；

熒光檢測(cè)：檢測(cè)螢火蟲/海腎熒光素酶活性，計(jì)算相對(duì)活性

結(jié)果判定：雙因子共轉(zhuǎn)組活性顯著高于/低于單因子組，證明轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物協(xié)同激活/抑制靶基因轉(zhuǎn)錄。

結(jié)果示例：

圖4. 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。EV+EV+EV：空載+空載+空載；EV+a+EV：空載+靶基因啟動(dòng)子+空載；TF1+a+EV：轉(zhuǎn)錄因子1+靶基因啟動(dòng)子+空載；TF2+a+EV：轉(zhuǎn)錄因子2+靶基因啟動(dòng)子+空載；TF1+a+TF2：轉(zhuǎn)錄因子1+靶基因啟動(dòng)子+轉(zhuǎn)錄因子2。

藍(lán)景科信：轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究的合作伙伴

藍(lán)景科信深耕功能基因組學(xué)領(lǐng)域，累計(jì)完成260+物種，4000+轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，憑借高質(zhì)量的服務(wù)，已助力合作客戶在Cell，Science，Molecular Plant，Plant Biotechnology Journal，Journal of Advanced Research，Plant Cell，PNAS等數(shù)十期刊發(fā)表高質(zhì)量研究成果。

藍(lán)景科信核心服務(wù)體系涵蓋DAP-seq、dDAP-seq及ChIP-seq等組學(xué)技術(shù)，同時(shí)配套EMSA、Dual-LUC、Y1H、ChIP-qPCR等下游驗(yàn)證方案，并提供蛋白Pull-down、Y2H、Co-IP等全套蛋白互作服務(wù)。打造“組學(xué)檢測(cè)—功能驗(yàn)證—互作分析"一站式轉(zhuǎn)錄因子研究解決方案，支撐科研工作高效推進(jìn)！

參考文獻(xiàn)

[1]       Galli M, Chen Z, Ghandour T, et al. Transcription factor binding divergence drives transcriptional and phenotypic variation in maize. Nat Plants. 2025;11(6):1205-1219. doi:10.1038/s41477-025-02007-8

[2]       Li M, Yao T, Lin W, et al. Double DAP-seq uncovered synergistic DNA binding of interacting bZIP transcription factors. Nat Commun. 2023;14(1):2600. Published 2023 May 5. doi:10.1038/s41467-023-38096-2