【中文題目】小鼠棕色和白色脂肪細(xì)胞翻譯圖譜分析，鑒定代謝相關(guān)的小開(kāi)放閱讀框和功能性微蛋白

【文章題目】Profiling Mouse Brown and White Adipocytes to Identify Metabolically Relevant Small ORFs and Functional Microproteins

【發(fā)表期刊】Cell Metabolism（Q1，IF 27.7）

【發(fā)表年份】2023年

【研究團(tuán)隊(duì)】美國(guó)西雅圖諾和諾德研究中心Christopher A. Barnes團(tuán)隊(duì)和美國(guó)索爾克生物研究所Alan Saghatelian團(tuán)隊(duì)共同合作

【研究技術(shù)】核糖體印跡測(cè)序（Ribo-Seq）和蛋白質(zhì)組學(xué)（DIA-MS）組合

【研究概要】本文利用Ribo-Seq分析了小鼠棕色、白色和米色脂肪細(xì)胞中的短開(kāi)放閱讀框（smORFs）和微蛋白（MPs），鑒定到未注釋的、具有MP編碼潛力的smORF 共3877個(gè)。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)驗(yàn)證，其中85個(gè)MP被確認(rèn)具有功能性，包括33個(gè)在血漿中循環(huán)的MP。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，許多MP在高脂飲食等生理?xiàng)l件下受到調(diào)節(jié)，并與已知的代謝基因呈現(xiàn)共表達(dá)。此外，Ribo-Seq 還提供了 Gm8773 翻譯的證據(jù)，該基因編碼一種與人類(lèi)和雞FAM237B同源的分泌微蛋白。Gm8773 在下丘腦弓狀核中高度表達(dá)，向肥胖小鼠腦室內(nèi)注射重組mFAM237B會(huì)引起食欲增加。這表明脂肪細(xì)胞MP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)于研究參與基本代謝和生理過(guò)程的代謝調(diào)節(jié)因子具有重要價(jià)值。

近年來(lái)，隨著核糖體圖譜分析和質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的微蛋白被鑒定出來(lái)，這不僅拓展了人們對(duì)蛋白質(zhì)的理解，也為生命科學(xué)研究開(kāi)辟了一個(gè)新方向。研究證明，許多微蛋白在細(xì)胞應(yīng)激、肌肉發(fā)育和代謝調(diào)控中發(fā)揮重要作用，然而，微蛋白的鑒定以及功能研究還有待深入發(fā)掘。脂肪組織不僅是能量?jī)?chǔ)存器官，還是一種內(nèi)分泌器官，能夠分泌多種代謝調(diào)節(jié)因子（如瘦素、脂聯(lián)素）以調(diào)節(jié)攝食、能量平衡和產(chǎn)熱。許多的微蛋白具有代謝調(diào)節(jié)功能，這提示微蛋白可能是代謝調(diào)節(jié)劑的豐富來(lái)源。肥胖和代謝疾病的高發(fā)，使得挖掘新的代謝調(diào)控因子尤為重要。

研究結(jié)果

1.采用Ribo-seq技術(shù)鑒定小鼠脂肪細(xì)胞中新型微蛋白編碼基因

為排除脂肪組織中多種細(xì)胞類(lèi)型的干擾，本研究采用原代小鼠棕色、白色和米色脂肪細(xì)胞，通過(guò)Ribo-Seq技術(shù)鑒定出3,877個(gè)未被注釋的小開(kāi)放閱讀框。其中，246個(gè)在三種脂肪細(xì)胞中共同表達(dá)，926個(gè)在至少兩種細(xì)胞中表達(dá)。這些smORF的長(zhǎng)度分布和氨基酸使用頻率與人類(lèi)細(xì)胞中觀察到的微蛋白特征高度一致。

smORF分類(lèi)：包括5’ UTR中的上游ORF（1,816個(gè)）、3’ UTR中的下游ORF（568個(gè)）、內(nèi)含子區(qū)域（947個(gè)）及非編碼RNA/基因間區(qū)域（536個(gè)）。uORFs可能調(diào)控下游主開(kāi)放閱讀框的翻譯，如代謝相關(guān)基因（如Insr、Igf1、Cd36、Ucp1等）中的uORFs，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這些含uORF的基因顯著富集于脂質(zhì)代謝、線粒體組織等代謝相關(guān)通路。微蛋白分類(lèi)：預(yù)測(cè)含有跨膜結(jié)構(gòu)域的MP有84個(gè)，具有信號(hào)肽的分泌型MP有183個(gè)，其中27個(gè)同時(shí)具備兩種特征。進(jìn)化保守性：204個(gè)smORF在哺乳動(dòng)物中高度保守，273個(gè)小鼠smORF與人類(lèi)具有高度序列相似性，提示其潛在功能的重要性。組織分布：122個(gè)含smORF的轉(zhuǎn)錄本在脂肪組織中特異性表達(dá)，提示其在脂肪生物學(xué)中可能發(fā)揮重要作用。

圖1. Ribo-seq鑒定脂肪組織中的smORF和MP

2.蛋白質(zhì)組學(xué)驗(yàn)證微蛋白表達(dá)

采用DIA-MS和DDA-MS聯(lián)合策略，在原代脂肪細(xì)胞裂解液及條件培養(yǎng)基中驗(yàn)證了多個(gè)微蛋白的表達(dá)。其中，Gm14023-MP和CELF2-MP在棕色與白色脂肪細(xì)胞間存在顯著差異。該方法為短肽的精準(zhǔn)定量提供了高靈敏度的工作流程。

圖2. DIA-MS工作流程

3.小鼠和人類(lèi)mRNA中的uORF啟示

Pten是一個(gè)已知的腫瘤抑制因子，可促進(jìn)BAT中的Ucp1表達(dá)升高，在小鼠中的高表達(dá)可改善脂肪組織代謝和整體代謝健康。小鼠與人類(lèi)Pten基因均含有保守的uORF，可編碼一個(gè)由45個(gè)氨基酸組成的MP，提示其可能兼具翻譯調(diào)控與獨(dú)立功能。

PPAR-δ是一種重要的核受體，在維持能量平衡方面具有廣泛的作用，而Ppar-δ基因敲除小鼠的代謝活性較低，葡萄糖不耐受。小鼠與人類(lèi)PPAR-δ基因都含有uORF，雖然序列不保守，但均被翻譯，提示uORF本身的存在而非編碼序列可能是翻譯調(diào)控的關(guān)鍵。

總之，Pten和Ppar-δ基因均含有功能性u(píng)ORF，且可翻譯成微蛋白的例子，為進(jìn)一步研究uORF和MP功能提供了有趣的啟發(fā)。

圖3. 肥胖小鼠模型中smORF表達(dá)呈顯著差異

4.肥胖小鼠模型中smORF表達(dá)顯著改變

在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型中，多個(gè)脂肪組織中的smORF表達(dá)發(fā)生顯著變化，并與脂代謝、線粒體功能等通路相關(guān)。PCA分析顯示，smORF表達(dá)譜可有效區(qū)分不同脂肪組織類(lèi)型及代謝狀態(tài)。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)一步揭示，多個(gè)smORF與代謝關(guān)鍵基因（如Lpl、Adipoq、Ghr）協(xié)同表達(dá)，提示其可能參與能量代謝調(diào)控、胰島素敏感性、能量平衡等生理過(guò)程。

圖4. 脂肪中的smORFs與代謝相關(guān)基因呈現(xiàn)共表達(dá)

5.在血漿中檢測(cè)到循環(huán)的微蛋白

通過(guò)DIA-MS分析不同月齡肥胖與瘦鼠的血漿蛋白質(zhì)組，共檢測(cè)到33個(gè)循環(huán)微蛋白。其中，AW112010-MP被證實(shí)為循環(huán)因子，F(xiàn)RS2 uORF-MP在老年肥胖小鼠血漿中顯著上調(diào)，提示其可能作為代謝相關(guān)生物標(biāo)志物。

圖5. 老年肥胖小鼠血漿蛋白質(zhì)組學(xué)分析

6.Gm8773編碼促食欲的神經(jīng)分泌微蛋白FAM237B

Ribo-Seq證實(shí)Gm8773在脂肪細(xì)胞中翻譯，編碼一個(gè)由132個(gè)氨基酸組成的分泌型微蛋白，與雞和人的FAM237B同源（神經(jīng)分泌蛋白GM，簡(jiǎn)寫(xiě)NPGM）。原位雜交顯示其在下丘腦弓狀核高表達(dá)，并與NPY神經(jīng)元共定位（促食欲神經(jīng)元）。腦室內(nèi)注射重組mFAM237B可顯著促進(jìn)肥胖小鼠攝食，揭示了Gm8773作為促食欲因子在攝食調(diào)控中的作用。

圖6. 小鼠中微蛋白Gm8773的表達(dá)、定位和功能驗(yàn)證

研究小結(jié)

本研究通過(guò)多組學(xué)策略鑒定了小鼠脂肪細(xì)胞中大量未被注釋的smORF及其編碼的微蛋白，揭示了其在代謝調(diào)控中的潛在重要功能。特別是Gm8773/FAM237B的發(fā)現(xiàn)，為攝食行為的神經(jīng)調(diào)控提供了新的分子靶點(diǎn)。然而，該研究還存在一些局限性，例如：質(zhì)譜對(duì)短肽檢測(cè)靈敏度有限，大量預(yù)測(cè)的微蛋白尚未被驗(yàn)證；大多數(shù)微蛋白的生物學(xué)功能仍需通過(guò)基因敲除或過(guò)表達(dá)等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證；Gm8773的促食欲作用目前僅基于藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，其生理功能尚需遺傳學(xué)模型確認(rèn)。

研究意義

1.建立了一套適用于短肽鑒定的高靈敏度Ribo-Seq + DIA-MS聯(lián)合策略；

2.提供了小鼠脂肪細(xì)胞smORF和微蛋白的全面數(shù)據(jù)庫(kù)，為后續(xù)功能研究奠定基礎(chǔ)；

3.揭示代謝相關(guān)基因中uORF的翻譯調(diào)控新機(jī)制；

4.新發(fā)現(xiàn)的微蛋白可作為代謝調(diào)節(jié)因子或生物標(biāo)志物，為肥胖和糖尿病治療提供新靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Martinez TF, Lyons-Abbott S, Bookout AL, De Souza EV, Donaldson C, Vaughan JM, Lau C, Abramov A, Baquero AF, Baquero K, Friedrich D, Huard J, Davis R, Kim B, Koch T, Mercer AJ, Misquith A, Murray SA, Perry S, Pino LK, Sanford C, Simon A, Zhang Y, Zipp G, Bizarro CV, Shokhirev MN, Whittle AJ, Searle BC, MacCoss MJ, Saghatelian A, Barnes CA. Profiling mouse brown and white adipocytes to identify metabolically relevant small ORFs and functional microproteins. Cell Metab. 2023 Jan 3;35(1):166-183.e11.