文獻(xiàn)題目：LpMPK6 regulates leaf color in perennial ryegrass by inhibiting LpMYBR1-modulated transcription of LpNRT1.5

發(fā)表期刊：Journal of Integrative Plant Biology

影響因子：9.3

發(fā)表時(shí)間：2026年3月12日

發(fā)表單位：西北農(nóng)林科技大學(xué)

藍(lán)景科信提供：DAP-seq技術(shù)服務(wù)

主要研究內(nèi)容

草坪草葉色是評(píng)判其觀賞價(jià)值與生長健康狀態(tài)的核心指標(biāo)，氮素是構(gòu)成葉綠素的關(guān)鍵元素，硝態(tài)氮的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)過程顯著影響草坪草葉色表型，而多年生黑麥草中氮素介導(dǎo)葉色調(diào)控的分子機(jī)制一直未被闡明。本研究發(fā)現(xiàn)，低氮/缺營養(yǎng)條件下，LpMPK6過表達(dá)株系葉片黃化加劇，葉綠素、總氮及硝態(tài)氮含量降低，RNAi株系則保持綠葉、氮素與葉綠素含量更高，證明LpMPK6負(fù)調(diào)控黑麥草葉色與氮積累。經(jīng)酵母雙雜交、Pull-down、Co-IP、熒光素酶互補(bǔ)等實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LpMPK6與轉(zhuǎn)錄因子LpMYBR1特異性互作，且二者功能拮抗，LpMYBR1能夠改善植株在低氮環(huán)境下的葉片持綠特性。

為挖掘LpMYBR1的下游靶基因，本研究借助DAP-seq技術(shù)開展全基因組篩選，共鑒定出90001個(gè)LpMYBR1結(jié)合峰，其中8.2%位于基因啟動(dòng)子區(qū)域；同時(shí)預(yù)測得到6個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)合基序。對(duì)啟動(dòng)子區(qū)對(duì)應(yīng)的靶基因進(jìn)行GO功能富集分析，顯著富集到6個(gè)氮素調(diào)控相關(guān)通路，并篩選出LpNRT1.5、LpNRT1.8等硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白候選基因。酵母單雜交、凝膠遷移及雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LpMYBR1能夠直接結(jié)合LpNRT1.5啟動(dòng)子并激活其轉(zhuǎn)錄，但對(duì)LpNRT1.8無調(diào)控作用。功能驗(yàn)證表明，定位于細(xì)胞膜的LpNRT1.5特異性介導(dǎo)硝態(tài)氮從根系向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)，并不參與根系對(duì)硝態(tài)氮的吸收。磷酸化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，LpMPK6可靶向磷酸化LpMYBR1的第18位T殘基，顯著削弱LpMYBR1的轉(zhuǎn)錄激活活性；該調(diào)控效應(yīng)會(huì)抑制LpNRT1.5表達(dá)，降低硝態(tài)氮根冠轉(zhuǎn)運(yùn)，最終導(dǎo)致葉片氮素與葉綠素合成受阻，引發(fā)葉片黃化。

該研究解析了多年生黑麥草中LpMPK6-LpMYBR1-LpNRT1.5的調(diào)控通路，優(yōu)化了葉色與氮素代謝的分子機(jī)理研究，對(duì)培育低氮適應(yīng)性強(qiáng)、觀賞品質(zhì)優(yōu)良的草坪草品種具有重要指導(dǎo)意義。

圖1. LpMPK6與LpMYBR1的相互作用。（A）酵母雙雜交（Y2H）實(shí)驗(yàn)顯示LpMPK6與LpMYBR1之間的相互作用。（B）熒光素酶互補(bǔ)成像（LCI）實(shí)驗(yàn)表明LpMPK6與LpMYBR1存在相互作用。（C）下拉實(shí)驗(yàn)顯示GST-LpMPK6與His-LpMYBR1的結(jié)合關(guān)系。（D）共免疫沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)證實(shí)植物中LpMYBR1-GFP可與LpMPK6-Flag結(jié)合。

圖2. LpMYBR1調(diào)控LpNRT1.5的轉(zhuǎn)錄。（A）通過DAP-seq鑒定出的LpMYBR1結(jié)合峰在全基因組范圍內(nèi)的分布。（B）推定LpMYBR1靶基因的GO富集情況。（C、D）野生型、LpMYBR1過表達(dá)株及RNAi處理幼苗中15NO3-的吸收效率（C）和根-莖轉(zhuǎn)運(yùn)效率（D）。（E）野生型、LpMYBR1過表達(dá)株及RNAi處理幼苗中LpNRT1.5的轉(zhuǎn)錄水平。（F）LpNRT1.5啟動(dòng)子片段示意圖。（G）LpMYBR1與截短啟動(dòng)子（pLpNRT1.5T）結(jié)合的酵母單雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（H）LpMYBR1與F1/F2啟動(dòng)子片段結(jié)合的EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（I）雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)中使用的效應(yīng)基因與報(bào)告基因構(gòu)建體示意圖。（J）雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)的代表性熒光圖像。（K）LUC/REN熒光素酶活性相對(duì)值。