在全球氣候變暖背景下，干旱已成為威脅植物生長(zhǎng)的重大挑戰(zhàn)。在植物中，根系是干旱脅迫信號(hào)的主要感知器，其發(fā)育直接影響抗旱能力。然而，在樹(shù)木中不定根（ARs）和側(cè)根（LRs）對(duì)非生物脅迫的協(xié)調(diào)反應(yīng)所依據(jù)的理論仍不清晰。

近日，東北林業(yè)大學(xué)-楊靜莉研究團(tuán)隊(duì)在Plant Physiology（IF=6.5）發(fā)表題為PuUBL5-mediated ZINC FINGER PROTEIN 1 stability is critical for root development under drought stress in Populus ussuriensis的研究論文，該研究借助DAP-seq技術(shù)揭示了楊樹(shù)通過(guò)“分子開(kāi)關(guān)"PuZFP1協(xié)調(diào)側(cè)根抑制與不定根伸長(zhǎng)的抗旱策略，為抗旱林木的遺傳改良提供了新的理論依據(jù)。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

PuZFP1含有典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域（氨基酸43-65）和一個(gè)C端高度保守的EAR抑制基序（DLSLRL），與擬南芥AtZP1高度同源（結(jié)構(gòu)相似性＞60%），定位在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)。RT-qPCR和啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS染色結(jié)果顯示，干旱和ABA處理顯著誘導(dǎo)PuZFP1表達(dá)，并且在于根系分化區(qū)（DZ）和伸長(zhǎng)區(qū)（EZ）特異性表達(dá)，與側(cè)根發(fā)生和不定根伸長(zhǎng)區(qū)域重疊。酵母轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)和Gal4-GUS/LUC系統(tǒng)結(jié)果表明，PuZFP1是轉(zhuǎn)錄抑制因子，并且EAR基序是PuZFP1發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能的必需結(jié)構(gòu)。通過(guò)構(gòu)建PuZFP1過(guò)表達(dá)（OE）和RNA干擾（RNAi）株系，發(fā)現(xiàn)PuZFP1負(fù)調(diào)控側(cè)根（LR）形成，正調(diào)控不定根（AR）伸長(zhǎng)，在楊樹(shù)根系響應(yīng)干旱脅迫中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。

圖1. PuZFP1的生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析。

圖2. PuZFP1賦予楊樹(shù)抗旱能力。

圖3. PuZFP1賦予楊樹(shù)抗旱能力。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PuZFP1的穩(wěn)定性受泛素樣蛋白PuUBL5調(diào)控。酵母雙雜交（Y2H）、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）和Pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PuZFP1與PuUBL5直接互作，且PuZFP1通過(guò)26S 蛋白酶體途徑降解。蛋白酶體抑制劑MG132處理實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，阻斷蛋白酶體途徑可顯著抑制PuZFP1降解，驗(yàn)證了該降解機(jī)制的依賴性。

圖4. PuZFP1與PuUBL5相互作用，并發(fā)生PuUBL5介導(dǎo)的降解。

為確定PuZFP1的靶基因，研究團(tuán)隊(duì)將DAP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析，鑒定出PuZFP1的下游靶基因PuWRKY46和 PuEGR1。DAP-seq結(jié)果顯示，PuZFP1主要結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）附近，在所有的結(jié)合峰中，啟動(dòng)子區(qū)占比19%，基因間區(qū)占比65%。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，PuZFP1對(duì)這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子具有轉(zhuǎn)錄抑制作用，同時(shí)ABA處理抑制了PuZFP1與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合。

結(jié)合EMSA實(shí)驗(yàn)和靶基因功能研究發(fā)現(xiàn)PuZFP1通過(guò)結(jié)合PuWRKY46啟動(dòng)子中的CAGTG元件抑制其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而阻斷側(cè)根原基形成；同時(shí)，通過(guò)抑制PuEGR1（含TTTTGTTT結(jié)合基序）的表達(dá)，解除對(duì)不定根伸長(zhǎng)區(qū)（EZ）細(xì)胞伸長(zhǎng)的抑制。

圖5. PuZFP1靶基因的鑒定和直接結(jié)合驗(yàn)證。

圖6. PuWRKY46楊樹(shù)抗旱能力。

圖7. PuEGR1賦予楊樹(shù)抗旱能力。

結(jié)合激素信號(hào)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)PuZFP1通過(guò)協(xié)調(diào)脫落酸（ABA）與生長(zhǎng)素（IAA）信號(hào)通路，雙向調(diào)控根系發(fā)育：在根系分化區(qū)（DZ），PuZFP1抑制靶基因PuWRKY46的表達(dá)，導(dǎo)致該區(qū)ABA含量升高、IAA含量降低，ABA/IAA比例升高，從而抑制側(cè)根（LR）原基的形成與萌發(fā)；而在伸長(zhǎng)區(qū)（EZ），PuZFP1抑制PuEGR1的表達(dá)，使該區(qū)ABA含量降低、IAA含量升高，ABA/IAA比例降低，進(jìn)而促進(jìn)不定根（AR）細(xì)胞的伸長(zhǎng)。這種ABA與生長(zhǎng)素的時(shí)空比例調(diào)控，是PuZFP1介導(dǎo)根系結(jié)構(gòu)適應(yīng)干旱脅迫的核心機(jī)制。

圖8. PuZFP1表達(dá)與ABA/auxin途徑聯(lián)合調(diào)控根系發(fā)育。

綜上所述，本研究揭示了PuUBL5-PuZFP1模塊通過(guò)ABA /auxin信號(hào)調(diào)控根系發(fā)育的機(jī)制，為楊樹(shù)抗旱分子育種提供了理論依據(jù)。

圖9. 楊樹(shù)PuZFP1-PuUBL5模塊響應(yīng)干旱脅迫下的模型。

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