介紹

細胞遷移是胚胎早期發(fā)育和免疫細胞反應(yīng)等生物學現(xiàn)象的重要過程。在炎癥發(fā)生過程中，T細胞通過血管系統(tǒng)向炎癥部位募集是一個重要的階段。這些T細胞被不同的細胞因子招募，如促炎細胞因子(TNFα， IFN-γ)和趨化因子。在被募集和粘附到內(nèi)皮細胞后，T細胞需要通過一個稱為穿內(nèi)皮遷移(TEM)的過程跨越血管壁遷移到炎癥組織。此過程需要活體組織復(fù)雜的3D環(huán)境對其成功導(dǎo)航，并通過重塑胞外基質(zhì)（ECM）或改變細胞形狀來擠壓致密結(jié)構(gòu)來完成。
在本研究中，我們利用MIMETAS ' OrganoPlate®3-Lane 40開發(fā)了一種體外實驗，以研究灌注條件下與血管結(jié)構(gòu)相結(jié)合的T細胞動力學。將人原代T細胞置于血管腔中，研究在各種因素存在與否的情況下，隨后外滲和遷移到鄰近的ECM的情況。我們用高內(nèi)涵進行成像來觀察細胞在不同時間點的遷移情況。這里，我們介紹了成像和圖像分析方法用于量化在不同濃度的促炎細胞因子作用下進行跨內(nèi)皮細胞遷移的細胞數(shù)量。

優(yōu)勢

• 創(chuàng)建易于規(guī)?；摹⑴c高內(nèi)涵兼容的復(fù)雜的細胞遷移分析

• 進行免疫細胞動力學的定量評估，大量得到分析數(shù)據(jù)如細胞數(shù)量和細胞遷移距離

材料
• OrganoPlate platform(MIMETAS) 
• Endothelial cell source
• CD3+ T cells
• AIM V media (Invitrogen, 12055091))
• Collagen I 5 mg/mL (AMSbio Cultrex 3D collagen I rat tail, 5 mg/mL, #3447-020-01)
• 1M HEPES (Life Technologies 15630-122)
• 37g/L NaHCO3 (Sigma S5761-500G)
• PBS (Sigma)
• CellTracker Orange CMRA (Invitrogen, C34551)
• CD3/CD28 Human T-activators DynaBeads(Gibco, 11161D)
• TNFα (R&D systems, 210-TA-020)
• Chemokine trigger
• Image Xpress Micro Confocal(Molecular Devices) 
• MetaXpress Software，version 6.6(Molecular Devices) 
方法

模型

為了評估灌注條件下與血管結(jié)構(gòu)相結(jié)合的T細胞動力學，我們在OrganoPlate 3通道中培養(yǎng)了一根內(nèi)皮血管。在頂部灌注通道中，內(nèi)皮細胞以10,000個細胞/芯片的密度接種在I型膠原細胞外基質(zhì)(ECM)上。附著后在灌注條件下保持培養(yǎng)，在灌注通道內(nèi)生成3D微血管。微血管的炎癥狀態(tài)通過以劑量依賴性方式添加促炎細胞因子TNFα來模擬，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞粘附，參與內(nèi)皮細胞的跨內(nèi)皮遷移。在這個模型中，通過在3通道有機板的底部通道中加入趨化因子，得到一個趨化因子梯度 。CD3+T細胞使用CD3/CD28人T細胞激活劑Dynabeads刺激或未刺激48小時后，標記細胞，可以實時跟蹤T細胞從內(nèi)皮血管外滲到鄰近的細胞外基質(zhì)過程。

Figure1. 
T細胞灌注內(nèi)皮芯片模型的建立。A)示意圖顯示了OrganoPlate®3-Lane 40的40個微流控芯片之一，包括三個通道:兩個介質(zhì)灌注通道和中間的凝膠通道，每個通道由Phaseguides™分隔。這些通道連接在芯片的中心，被觀察窗口(OW)覆蓋。B)建立免疫細胞灌注內(nèi)皮芯片模型的細胞種植方案示意圖。 

 

Figure 2. 圖像采集與分析工作流程。A) ImageXpress高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)(Molecular Devices)。B) MetaXpress自定義模塊編輯器用戶界面。圖像處理步驟顯示在頁面左邊，當前步驟的圖像和結(jié)果的預(yù)覽顯示在右邊，完整的工作流顯示在底部的縮略圖中。 

實驗準備
培養(yǎng)CD3+ T細胞，部分組使用人T細胞激活劑Dynabeads刺激48小時。 
成像和分析
使用ImageXpress®Micro共聚焦系統(tǒng)(Molecular Devices)固定時間間隔拍攝T細胞外滲和組織的圖像。采用10倍空氣物鏡(0.45NA)和60μm共聚焦轉(zhuǎn)盤以0.69x0.69x3µm/pixel (XYZ)的分辨率獲取Z軸的熒光圖像。然后圖像沿z軸做了投影，創(chuàng)建了圖片的最大熒光強度投影(MIPs)。 
然后對所有圖像使用MetaXpress軟件(Version 6.6, Molecular Devices)定制模塊編輯器(CME)自定義分析方法進行分析(圖3)。簡單地說，CME包含細胞核計數(shù)應(yīng)用模塊，在該模塊中，T細胞根據(jù)大小和與背景的熒光差值被識別。一系列分析步驟被用來識別遷移至ECM通道的細胞群(圖2)。每個實驗都對ECM通道的位置進行精準識別，以校正不同板之間和板加載時的位移變化。

結(jié)果

無論CD3+ T細胞受刺激與否，均能觀察到細胞的跨內(nèi)皮遷移(TEM)。兩類細胞均能觀察到時間依賴性效應(yīng)，盡管在未受刺激的條件下有更明顯的趨勢(圖4B和4C)。在受刺激的條件下，在24小時的時間點幾乎沒有觀察到TEM的增加，而在未受刺激的條件下，在24小時和48小時的時間點觀察到受TNFα劑量依賴性的細胞遷移。在48h時間點，受刺激的T細胞發(fā)生跨內(nèi)皮遷移的總數(shù)量明顯大于未受刺激的組。TEM似乎是由非刺激條件下TNFα介導(dǎo)的效應(yīng)和刺激條件下的刺激本身驅(qū)動的。

Figure 3.
為高通量圖像分析進行自定義模塊編輯器設(shè)置。A)展示了用于識別T細胞類群的主要步驟。利用細胞核計數(shù)應(yīng)用模塊檢測圖像中的所有細胞。識別結(jié)果通過位置(質(zhì)心Y)和區(qū)域進行過濾，以更準確地識別ECM通道內(nèi)的細胞。如果需要，可以再加入位置的附加過濾，根據(jù)細胞向底部通道的遷移程度進行分類。具體的測量參數(shù)，包括細胞數(shù)，面積，強度，圓度，也可以通過測量參數(shù)選項卡選擇。B)內(nèi)皮血管與CD3+ T細胞的相差圖像。C)當前樣品的Cy5熒光信號，放大圖。D) CME分析結(jié)果顯示位于ECM通道中CD+ T細胞的分割覆蓋。藍綠色標記的細胞位于ECM通道的上半部分，黃色標記的細胞位于ECM通道的下半部分。檢查圖像是否存在可能被分割算法錯誤識別的成像偽影。

Figure 4. 有/無預(yù)刺激的T細胞在TNFα作用后的遷移響應(yīng)。A)未受刺激的T細胞在TNFα作用0小時、4小時、24小時、48小時的圖像。觀察到內(nèi)皮細胞屏障對面的細胞數(shù)量隨著時間的推移在增加。B) TNFα作用下，受刺激T細胞的遷移數(shù)量。C) TNFα作用下，未受刺激T細胞的遷移數(shù)量。x軸顯示TNFα的作用濃度，以pg/ml為單位。

結(jié)論
總之，我們利用高通量微流控平臺開發(fā)了一種新穎的3D T細胞外滲和遷移實驗。使用高內(nèi)涵，可以精確提取和評估不同條件下單個T細胞的遷移行為。此遷移實驗捕捉了在灌流下T細胞對血管內(nèi)皮的附著，并由血管壁外滲到下面的組織中。該實驗不受人工膜的影響，并允許3D ECM樣支架和多細胞的共培養(yǎng)，這是模擬體內(nèi)環(huán)境的關(guān)鍵要求。我們相信，該實驗將提高目前對T細胞遷移行為的認識，并可以帶動免疫腫瘤學和自身免疫領(lǐng)域新療法的發(fā)展。