顯微鏡(熒光倒置顯微鏡）國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口如何選擇
一般教學(xué)用途及要求的，建議使用國(guó)內(nèi)產(chǎn)品；科學(xué)研究等特殊要求的，建議采購(gòu)進(jìn)口產(chǎn)品。國(guó)產(chǎn)品牌沒(méi)有高質(zhì)量熒光激發(fā)塊，同時(shí)也沒(méi)有高數(shù)值孔徑物鏡，視野僅22mm，而進(jìn)口品牌有高質(zhì)量熒光激發(fā)塊，物鏡數(shù)值孔徑可達(dá)到0.7，視野25mm，可以獲得高清晰圖像、具有更大觀察及成像面積。
熒光顯微鏡是利用特定波長(zhǎng)的光照射被檢物體產(chǎn)生熒光進(jìn)行鏡檢的顯微光學(xué)觀測(cè)技術(shù)，已有100多年歷史。近年來(lái)，由于免疫熒光在醫(yī)學(xué)研究、診斷領(lǐng)域里的廣泛應(yīng)用，F(xiàn)ISH、綠色熒光蛋白(GFP)技術(shù)分別在基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面的推廣，顯微照相、數(shù)字CCD成像技術(shù)的輔助驅(qū)動(dòng)，賦予這一傳統(tǒng)技術(shù)更新的應(yīng)用價(jià)值和生命力。
基本原理
熒光：是一種非溫度輻射冷光，據(jù)發(fā)生性質(zhì)可分為光化熒光(由特定光源光譜激發(fā)而產(chǎn)生的熒光)、放射熒光(放射性物質(zhì)激發(fā))、生物熒光(生物體發(fā)出)、化學(xué)熒光(如磷氧化時(shí))等。
熒光現(xiàn)象：某物質(zhì)在受到某種特定波長(zhǎng)的高能量光(短波長(zhǎng))照射后獲取能量，幾乎即時(shí)(約在10～15s后)其分子內(nèi)的電子躍遷到較高能級(jí)軌道使分子進(jìn)入激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的分子不通過(guò)內(nèi)部轉(zhuǎn)換方式消耗能量回到基態(tài)，而是釋放出相應(yīng)較低能量的光量子→人眼可見(jiàn)的熒光(較長(zhǎng)波長(zhǎng))。
熒光現(xiàn)象有兩種：一次熒光現(xiàn)象，又稱“固有熒光”或“自發(fā)熒光”，是指經(jīng)照射后，就能發(fā)出熒光的物質(zhì)，此類物質(zhì)的化學(xué)特征是發(fā)光分子具有共軛雙鍵，π電子活動(dòng)性大。二次熒光現(xiàn)象，又稱“繼發(fā)熒光”，物質(zhì)經(jīng)照射后不能或只能部分發(fā)生微弱的熒光，這樣就需先用熒光色素(或稱熒光染料、熒光探針)標(biāo)記處理，將熒光色素標(biāo)記結(jié)合插入到不發(fā)光的活性分子中去，再經(jīng)照射才能發(fā)生熒光。熒光色素應(yīng)具備的基本條件是能與不發(fā)光分子的某個(gè)區(qū)域有特異性的牢固結(jié)合，同時(shí)不會(huì)影響被結(jié)合分子的結(jié)構(gòu)和特性，光量子效率應(yīng)≥013。
熒光的產(chǎn)生包含了激發(fā)(Excitation)和發(fā)射(Emission)兩個(gè)過(guò)程，激發(fā)光譜短于發(fā)射光譜，故光色不同。而不同的熒光物質(zhì)或熒光色素有其最敏感而有效的激發(fā)波長(zhǎng)，因此選擇合適的激發(fā)/發(fā)射光譜以獲得的熒光鏡像質(zhì)量是實(shí)驗(yàn)中要首先考慮的。
熒光顯微鏡是利用“光化熒光”成像，如果所選激發(fā)波長(zhǎng)在肉眼所看不見(jiàn)的近紫外光區(qū)(320～400nm)，熒光的發(fā)射光譜也較普通光鏡光源的平均波長(zhǎng)短，光學(xué)分辨率提高。
應(yīng)用要點(diǎn)
1)預(yù)檢查和調(diào)節(jié)
(1)每次進(jìn)行熒光觀測(cè)前，必須例行檢查熒光裝置的燈絲對(duì)中、光路對(duì)焦、孔徑光闌、視場(chǎng)光闌設(shè)置等狀況。
(2)所需要的熒光激發(fā)/發(fā)射濾光片組件是否已裝在轉(zhuǎn)換器中，物鏡配置是否得當(dāng)，除去物鏡前透鏡的油漬和灰塵。
(3)如同時(shí)進(jìn)行透射光相差觀察，要檢查聚光鏡對(duì)中心及相差環(huán)與物鏡相反的共軛情況。
(4)檢查樣品載體(載玻片、蓋玻片和其他器皿)有否掛有液體、灰塵，厚度是否在物鏡標(biāo)定的工作距離范圍內(nèi)。切片樣品不能太厚，約≤10μm為宜。
(5)因照明光源含有紫外線，在載物臺(tái)前上方放一塊棕色遮光板，以防紫外線損傷視網(wǎng)膜。
(6)電壓不穩(wěn)會(huì)降低高壓汞燈的使用壽命，光源電源加配穩(wěn)壓器。
(7)為延長(zhǎng)汞燈壽命，在開(kāi)啟后15min方可關(guān)閉；汞燈熒光電源一旦關(guān)閉，再次啟動(dòng)至少需等待10min，以使水銀蒸汽冷卻復(fù)至原態(tài)，否則會(huì)影響燈的壽命。
2)熒光鏡像觀察
(1)在開(kāi)啟熒光燈源后約5～10min激發(fā)光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，裝載樣品進(jìn)行觀察；為防止在調(diào)焦和尋找物像過(guò)程中過(guò)度激發(fā)光照會(huì)造成樣品熒光淬滅，先通過(guò)縮小熒光照明器的孔徑光闌或加ND濾光片將激發(fā)光調(diào)節(jié)到適度強(qiáng)度，有規(guī)律地移動(dòng)樣品臺(tái)，待確定鏡像后，在調(diào)節(jié)到熒光狀態(tài)用于拍攝記錄。
(2)鏡像質(zhì)量不佳的調(diào)整。排除樣品制備因素外，可進(jìn)行的必要調(diào)節(jié)措施是：
?、倥懦上窆饴分械恼诠饣蛳薰馄骷?，如DIC附件、ND濾光片等。
?、谥匦抡{(diào)節(jié)熒光照明器的收光器對(duì)焦和孔徑光闌大小。
?、奂?xì)心調(diào)節(jié)物鏡覆蓋差校正環(huán)。
④復(fù)查熒光激發(fā)/發(fā)射組件是否與所標(biāo)記的熒光色素對(duì)應(yīng)。
(3)在不影響分辨率的前提下，于照相取景框和CCD靶面范圍之外，可盡量回縮熒光光路視場(chǎng)光闌和物鏡(100X物鏡)的數(shù)值孔徑光闌調(diào)節(jié)環(huán)，以避免雜散光的影響、提高景深，并可減小激發(fā)面積防止附加樣品淬滅。
(4)暫時(shí)不觀察時(shí)，應(yīng)阻斷激發(fā)光路。
(5)油鏡觀察時(shí)，須用“無(wú)熒光油”，尤其是在U、V激發(fā)時(shí)，因常規(guī)鏡檢用的香柏油帶有青色熒光。
3)熒光照相和數(shù)字CCD相機(jī)圖像采集
(1)熒光照相
?、俦M管肉眼觀察熒光鏡像亮度與普通明場(chǎng)相差無(wú)幾，而實(shí)際上曝光時(shí)間要增加數(shù)倍甚至幾十倍，應(yīng)使用快速感光膠片，如ISO200(24DIN)、ISO400(27DIN)。
②根據(jù)熒光物像在測(cè)光區(qū)的分布比例和鏡像的明暗程度設(shè)置曝光補(bǔ)償調(diào)節(jié)，原則上適當(dāng)增補(bǔ)償，以獲得背景黑暗熒光圖像明亮、鮮艷的照片效果。
③如果沒(méi)有照明標(biāo)線取景器，可先選擇較明亮的熒光區(qū)域進(jìn)行對(duì)焦調(diào)整。
?、軐?duì)點(diǎn)狀熒光物像或撲捉某點(diǎn)為主的拍攝，可選擇適當(dāng)?shù)狞c(diǎn)測(cè)光模式。
?、輰?duì)在同一幅需要同樣條件拍攝的分散點(diǎn)狀熒光物像，可試用點(diǎn)測(cè)光配合自動(dòng)鎖定方式拍攝。
⑥曝光過(guò)程應(yīng)避免任何振動(dòng)，有條件可配置防震臺(tái)。
(2)數(shù)字CCD相機(jī)圖像采集
?、俟鈱W(xué)接口的中間倍率要與CCD的芯片尺寸合理匹配。
?、诓捎煤线m的熒光拍攝模式，摸索減背景(Background Subtraction)處理?xiàng)l件，根據(jù)鏡像情況設(shè)置Binning、Gain、Gamma等參數(shù)。
?、垡駽CD芯片靈敏度較高，如果熒光鏡像過(guò)于明亮，為獲取對(duì)比度較好的采集圖像，可適當(dāng)縮小熒光照明器孔徑光闌或加ND濾光片，特別是在熒光輝光較強(qiáng)影響拍攝樣品細(xì)節(jié)的情況時(shí)。
實(shí)際工作中，為獲得較好的熒光圖像拍攝質(zhì)量需要對(duì)上述調(diào)節(jié)機(jī)制的綜合運(yùn)用，反復(fù)摸索、優(yōu)化條件。
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