惡性轉(zhuǎn)化細胞的誘發(fā)和培養(yǎng)方法！
惡性轉(zhuǎn)化細胞的誘發(fā)和培養(yǎng)方法！
細胞培養(yǎng)已成為研究癌癥的發(fā)病機制和腫瘤細胞生物學(xué)特性的常用方法。細胞培養(yǎng)提供的模型系統(tǒng)中，實驗變量可被嚴(yán)格控制，較使用整體動物更省時、價廉且易于操作。在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域取得的理論和技術(shù)進展的基礎(chǔ)上，細胞培養(yǎng)體外系統(tǒng)為腫瘤研究提供了新的方法和應(yīng)用領(lǐng)域，體外研究結(jié)果也為進一步的體內(nèi)研究提供可借鑒的資料。細胞培養(yǎng)技術(shù)的進一步發(fā)展，將為細胞惡變機制研究提供新的平臺，并將促進腫瘤的基礎(chǔ)研究與臨床防治研究。
本章主要介紹腫瘤學(xué)研究和臨床實踐中涉及細胞培養(yǎng)的一些成熟技術(shù)方法。關(guān)于腫瘤的生物治療技術(shù)，早在1985年美國國家癌癥中心已經(jīng)將生物治療正式列入腫瘤*的第四大模式。生物治療從臨床上廣泛應(yīng)用LAK,TIL細胞開始出現(xiàn)“火熱"，中間曾由于濫用現(xiàn)象而走入過一段低谷，發(fā)展到今天又迎來了一個應(yīng)用CIK細胞的高潮。由于過繼*的優(yōu)點決定了它在腫瘤生物治療中的地位，因為腫瘤特異性抗原的研究仍未取得實質(zhì)性的突破，腫瘤疫苗和靶向治療制劑的使用仍難達到理論上的期望值，恐怕過繼*在今后一段時間里仍將是腫瘤生物治療中重要的手段。關(guān)于LAK, TIL與CIK細胞的制備與功能檢測等。
節(jié)惡性轉(zhuǎn)化細胞的誘發(fā)和培養(yǎng)
癌變，即細胞惡性轉(zhuǎn)化，是一個發(fā)生在體內(nèi)的過程，在體外細胞培養(yǎng)條件下，也可以用人工方法誘發(fā)。人工誘發(fā)體外培養(yǎng)細胞的轉(zhuǎn)化，是研究癌變原理的重要方法，其優(yōu)點是重復(fù)性好，可用于研究各種可致癌因素的作用，細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后，能夠進行直接觀察和做各種分析。人工誘發(fā)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的體外癌變模型，不僅在理論研究中有重要作用，亦可應(yīng)用于檢測環(huán)境中的致癌物。
一、人工誘發(fā)細胞惡性轉(zhuǎn)化
在細胞培養(yǎng)條件下，用化學(xué)、物理和生物等各種致癌物可人為地誘發(fā)細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。條件是要讓細胞直接受到致癌物的作用，從細胞接觸致癌物到發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化一般需兩周到三個月的時間。
（一）細胞轉(zhuǎn)化基本過程
⒈誘發(fā)也稱啟動，是致癌物或誘變劑誘發(fā)DNA損傷的過程。誘發(fā)因素可分為物理因素，例如，射線；化學(xué)物質(zhì)，即致癌化合物以及生物因素，例如某些病毒（EB病毒、人瘤病毒等）、等。應(yīng)用射線時，可直接照射細胞，在用致癌化學(xué)物或病毒時，需把這些物質(zhì)加到培養(yǎng)物中，使之與細胞直接接觸，但細胞受致癌物作用時間過長，或致癌物劑量過大，可導(dǎo)致細胞死亡。因此應(yīng)用致癌物的劑量和作用時間要控制在能使細胞傷而不死，處于DNA合成階段的細胞易受到致癌物損傷，因此讓致癌物接觸細胞的時間不宜少于6小時，但也不得超過48小時。在實驗中常用的是致癌化學(xué)物，可分為直接致癌物與間接致癌物。直接致癌物如N-甲基-N’-硝基-N-亞( N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine ; MNNG）能直接損傷DNA誘發(fā)癌變；間接致癌物又稱前致癌物，需經(jīng)某些酶的活化，形成終末致癌物后，才能發(fā)生致癌的作用，終末致癌物具有強的親電子性質(zhì)，易與細胞核中含電子多的DNA,RNA和蛋白質(zhì)等相結(jié)合，從而導(dǎo)致DNA的損傷，發(fā)生轉(zhuǎn)化過程中的啟動作用。
⒉DNA的損傷與修復(fù)DNA損傷后可進行自我修復(fù)。修復(fù)是一復(fù)雜的過程，存在著不同修復(fù)機制和產(chǎn)生不同的結(jié)果。無誤性的修復(fù)可使損傷DNA復(fù)原，但錯誤性修復(fù)能引起DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。當(dāng)DNA損傷后如發(fā)生了錯誤性修復(fù)，而這種變化被固定下來即能引起不可逆的改變，標(biāo)志著DNA發(fā)生了突變。從啟動到損傷被固定下來，大約需24～48小時完成。
⒊發(fā)展和表現(xiàn)細胞DNA受損和被固定后，通過細胞的反復(fù)增殖，使細胞損傷進一步得到發(fā)展和表現(xiàn)。受到一定劑量致癌物處理的細胞群，并非所有細胞都一定受到損害。受到誘發(fā)并進入轉(zhuǎn)化發(fā)展階段的細胞僅是一小部分，這些細胞稱為癌前細胞（precancerouscell)。它們生長在那些未受損的正常細胞之中，這兩類細胞大約共同經(jīng)過12～15個細胞周期的增殖以后，可能細胞已相互匯合融合成片。正常細胞不再分裂，但那些散在的前癌細胞卻隨著轉(zhuǎn)化而不斷發(fā)展，細胞匯合后不發(fā)生接觸抑制，仍繼續(xù)分裂增殖，并由于數(shù)量的增多而堆積起來，形成明顯可見的轉(zhuǎn)化灶。
（二）轉(zhuǎn)化實驗方法
【材料】
⒈實驗用細胞進行轉(zhuǎn)化實驗需選用合適的細胞，來源主要分以下兩類
⑴原代細胞：原代培養(yǎng)的二倍體細胞易于制備，細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后也容易識別，動物和人的原代培養(yǎng)細胞皆可應(yīng)用。動物細胞以倉鼠胚胎成纖維細胞（embryonic fibroblast,EFs）較好，人原代細胞取自胚胎，小兒和成人真皮等。
⑵傳代細胞系：BALB/3T3,C3H10T1/2,BHK-21,NIH3T3,V79細胞株等均可。這些細胞的共同特點都已獲得了無限生長的能力，變成了傳代細胞系，也失去了二倍體核型，說明這些細胞都已發(fā)生了一定程度遺傳變化，但卻保持著正常細胞的接觸抑制特征，而且接種同源動物體內(nèi)無致癌性。
⒉培養(yǎng)液與試劑
⑴*培養(yǎng)液：85％高糖DMEM；15% FBS;O.1mM NEAA;2Mm/L*。
⑵低血清培養(yǎng)液：95％高糖DMEM;5% FBS;O.1mM NEAA;2Mm/L*。
⑶消化液：0.25% Trypsin-0.02% EDTA.
⑷凍存液：90% FBS;10% DMSO。
⑸Hanks液。
⑹MNN溶液。
【方法】
用原代細胞進行轉(zhuǎn)化實驗。多選用倉鼠13天的胚胎EFs。
⒈取數(shù)個或所有同窩胚胎，去頭和內(nèi)臟，在無菌條件下剪碎至米粒大小，再用消化液37℃消化30分鐘，吹打數(shù)次后過濾,1000r/min，離心5分鐘。去除上清消化液，加Hanks洗1次，沉淀細胞加入培養(yǎng)液，制備5x105/ml細胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)2～3天，能迅速長滿瓶。
⒉選生長狀態(tài)良好的細胞，液氮凍存?zhèn)溆茫▊鞔^多不利于細胞轉(zhuǎn)化）。
⒊致癌物處理凍存細胞解凍后，接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，每瓶含細胞（1～3)x105。待細胞生長進入指增*時，向培養(yǎng)瓶中加入致癌劑。致癌劑常用MNNG，劑量為1～3ug/ml營養(yǎng)液，在37℃孵箱中培養(yǎng)12～48小時。
⒋棄掉MNNG作用液，用溫PBS洗1～3次，加入培養(yǎng)液繼續(xù)置孵箱培養(yǎng)2～3周（如用人細胞需1～3個月），然后更換培養(yǎng)液，用含5％血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。低血清培養(yǎng)液不利于正常細胞生長，但已轉(zhuǎn)化了的細胞仍可增殖，易形成轉(zhuǎn)化灶。
⒌轉(zhuǎn)化灶的形成和分離用致癌物處理過的細胞于10天后，如果轉(zhuǎn)化成功，在正常細胞之間可產(chǎn)生數(shù)量不等的轉(zhuǎn)化灶。轉(zhuǎn)化灶由密集的重疊細胞群組成；灶的大小不等，小者由幾十或幾百個細胞構(gòu)成，大者肉眼可見。
⒍轉(zhuǎn)化現(xiàn)象出現(xiàn)后，為獲得純的轉(zhuǎn)化細胞群，應(yīng)把轉(zhuǎn)化灶分離出來。轉(zhuǎn)化灶分離可用兩種方法：
⑴刮除法：先在有轉(zhuǎn)化灶處瓶壁上用蠟筆圈出記號，再用膠皮刮刮掉未轉(zhuǎn)化的正常細胞，向瓶內(nèi)加入PBS沖洗掉刮除后，加0.25 % Trypsin少許置37℃孵箱中消化5～10分鐘，待細胞松散后，棄掉消化液，加入新鮮的含10％～20％小牛血清培養(yǎng)液，以終止殘余*消化作用，用吸管反復(fù)吹打轉(zhuǎn)化灶，使之脫離瓶壁成細胞懸液，再置37℃孵箱。
⑵消化法：先在瓶壁上用蠟筆圈出轉(zhuǎn)化灶，棄掉瓶內(nèi)培養(yǎng)液，選生長良好的轉(zhuǎn)化灶，用不銹鋼小環(huán)或無毒硅橡膠圈沾少許無菌明膠（不用亦可）套在轉(zhuǎn)化灶上；向圈中滴0.25% Trypsin充分消化后，用彎頭吸管把*與細胞一同吸出接種入新培養(yǎng)瓶中，再補加營養(yǎng)液少許；置孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。數(shù)日后轉(zhuǎn)化細胞迅速增殖成新的細胞群。
【結(jié)果】
⒈高倍鏡下觀察，轉(zhuǎn)化細胞與正常細胞不同，如系成纖維細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后，胞體變大成類多角形，生長無方向性，失去接觸抑制，向三度空間伸延，細胞相互重疊。在轉(zhuǎn)化灶的邊緣轉(zhuǎn)化細胞與正常細胞界限分明，形態(tài)區(qū)別非常明顯。上皮細胞轉(zhuǎn)化后，形態(tài)上不如成纖維細胞差別大，需仔細辨認。
⒉無限細胞系用BALB/3T3或C3 H10T1/2細胞等，比原代細胞操作更簡單，而且成功率高。轉(zhuǎn)化程序與原代培養(yǎng)細胞相同。
【注意事項】
MNN溶液，有毒，用時注意防止污染環(huán)境；避光陰涼處保存，實驗用液現(xiàn)配現(xiàn)用。用MNNG處理細胞不宜超過48小時。
（三）轉(zhuǎn)化細胞的檢測
用誘變劑或致癌劑誘發(fā)細胞轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化細胞群后，為確定轉(zhuǎn)化細胞的性狀，需進一步做一系列的實驗分析。
⒈細胞生物學(xué)一般性狀包括細胞形態(tài)、生長速度、倍增時間等。
⒉細胞遺傳學(xué)特征核型分析，染色體組型畸變和標(biāo)志染色體的有無。
⒊惡性測試侵襲性試驗，軟瓊脂培養(yǎng)，異體動物接種，凝集試驗等。
以上測試中重要的為第3項，說明發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞是否為惡性轉(zhuǎn)化。
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