三棱為黑三棱科植物黑三棱 Sparganium stoloniferum Buch.-Ham.的干燥塊莖，主要分布于 我國東北、黃河、長(zhǎng)江中下游流域，野生資源較 為豐富。三棱味辛、苦，性平，入肝、脾經(jīng)，具 有破血行氣、消積止痛等功能，用于癥瘕痞塊， 瘀血經(jīng)閉，食積脹痛，主要含有黃酮和黃酮苷、 苯丙素苷、甾體及其苷、有機(jī)酸等化合物。阿魏 酸具有抗血小板聚集、抗血栓等作用，這與三棱 活血化瘀的傳統(tǒng)功效相符，可能為破血活性成分； 黃酮類成分具有較強(qiáng)的抗血小板聚集、抗血栓和 鎮(zhèn)痛作用。本研究通過建立三棱藥材入血成分 對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸和蘆丁的含量測(cè)定方法，考察三棱藥材血中移行成分。
1 材料
1.1 藥材三棱藥材購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠， 經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院宋捷民教授鑒定為浙江 產(chǎn)三棱，符合中國藥典 2015 年版一部相關(guān)規(guī)定。
1.2 動(dòng)物SPF 級(jí) SD 大鼠，10 只，♂，體質(zhì)量 180~200 g， 由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可 證號(hào)：SCXK(滬)2014-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度 25~27 ℃，濕度 40%~60%，適度照明，食物充足， 自由飲水。
1.3 儀器及試劑Agilent 1200 型高效液相色譜儀器 ( 美 國 Agilent) ； Agilent Eclipse XDB-C18 色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；XS205DU 型精密天平 (Mettler Toledo 公司)；2-16PK 型離心機(jī)(德國 Sigma 公司)；QL-861 型渦旋混合儀(海門市其林貝爾儀器制造)；SK5210HP 型超聲波清洗儀(上?？?導(dǎo)超聲儀器有限公司)；ND100-1 型氮?dú)獯祾邇x(杭 州瑞誠儀器有限公司)。 乙腈(色譜純，批號(hào)：AS1122-801)、甲醇(色 譜純，批號(hào)：MS1922-801)購自 Tedia 公司；磷酸(成 都科龍化工試劑廠，分析純，批號(hào)：7664-38-2)； 水為超純水。對(duì)羥基苯甲酸對(duì)照品 ( 批號(hào)： MKBK3576V；純度≥99%)、香草酸對(duì)照品(批號(hào)： 110776-20150；純度：98%)、阿魏酸對(duì)照品(批號(hào)： 110773-20161；純度≥98%)、蘆丁對(duì)照品(批號(hào)： Y23M7N11586；純度≥98%)、內(nèi)標(biāo)物核黃素(批號(hào)： JS0925RA14；純度≥99%)均購自中國食品藥品檢 定研究院。
2 方法
2.1 三棱水煎液制備方法傳統(tǒng)煎煮法：三棱藥材 100 g，加去離子水 800 mL 浸泡 0.5 h 后進(jìn)行煎煮，煮沸 0.5 h，4 層濾 布濾出藥液，再次加水 500 mL 煮沸 0.5 h，濾過， 2 次藥液合并，濃縮至 50 mL，制成含生藥 2 g·mL?1 的三棱水煎液原液，110 ℃高壓滅菌 30 min，冰 箱冷凍保存。
2.2 含藥血清制備取 180~200 g 的 SD 大鼠 10 只，飼養(yǎng) 1 周。 按照生藥濃度 2 g·mL?1 ，劑量 0.2 mL·kg?1 ，計(jì)算 大鼠的常規(guī)給藥劑量；每天灌胃 1 次，連續(xù)灌胃 7 d。末次給藥前禁食 12 h，第 7 天末次給藥后， 于 1，2，4 h 分別從同一只大鼠眼眶靜脈叢取血， 收集大鼠血液至離心管中，3 000 r·min?1 離心 10 min，收集上層血清，56 ℃滅活 30 min，取出 后無菌過濾，后放入?20 ℃冰箱保存，為含藥血清。
2.3 對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)的配制精密稱取對(duì)羥基苯甲酸對(duì)照品、香草酸對(duì)照 品、阿魏酸對(duì)照品、蘆丁對(duì)照品適量，用甲醇水 溶液(1∶1)溶解，配制對(duì)照品濃度為 1 mg·mL?1 的 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，渦旋儀充分混勻，超聲30 min， 0.22 μm 微孔濾膜過濾，4 ℃保存，檢測(cè)前稀釋成 不同濃度。精密稱取內(nèi)標(biāo)物核黃素適量，用甲醇水溶液 (1∶1)溶解，配制內(nèi)標(biāo)物濃度為 1 mg·mL?1 的儲(chǔ)備 液，渦旋儀充分混勻，超聲 30 min，0.22 μm 微孔 濾膜過濾，4 ℃保存。
3 結(jié)果與分析按“2.4”項(xiàng)下方法處理大鼠空白血清，按“2.5” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，空白血清的 內(nèi)源性物質(zhì)與對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸和 蘆丁對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)物的分離度良好，且沒有干擾 物質(zhì)，內(nèi)源性物質(zhì)與各藥品及代謝物之間不存在 相互作用，說明方法的專屬性良好。血清中對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸和蘆丁的 回歸方程分別為 Y=56 971.00X+282.99(r 2 =0.999 8)， Y=36 756.00X+247.66(r 2 =0.999 7)，Y=50 686.00X+ 89.41(r 2 =0.999 8)，Y=36 349.00X+20.99 (r 2 =0.999 7)， 各成分均在質(zhì)量濃度 0.000 5~0.25 mg·mL?1 內(nèi)線 性關(guān)系良好。按信噪比(S/N)為 3 來計(jì)算，對(duì)羥基 苯甲酸、香草酸、阿魏酸、蘆丁的檢測(cè)限均 為 0.000 1 mg·mL?1 。計(jì)算得到各組含藥血清樣本的精密度 RSD<10%，方法回收率>90%，基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果 為 89.45%~95.12%；各組樣品穩(wěn)定性均 RSD<10%， 表明本實(shí)驗(yàn)精密度良好，回收率和穩(wěn)定性均符合 藥動(dòng)學(xué)要求。利用所建立的方法，對(duì)灌胃給予中藥三棱后 所采取的 10 只大鼠血清樣品進(jìn)行含量測(cè)定，說明該方法能夠簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確測(cè)定大鼠血漿 中三棱的 4 種有效成分的血藥濃度。
4 討論本研究采用 HPLC 梯度洗脫同時(shí)準(zhǔn)確、快速 測(cè)定三棱藥材入血成分對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、 阿魏酸和蘆丁的含量，分離效果好。色譜條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，水相加入適量的磷酸可以改善峰形并能 提高分離度，當(dāng)酸度為 0.1%時(shí)待測(cè)成分均可分離， 效果較好。本研究為進(jìn)一步研究三棱藥材活性成 分與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供一定的實(shí)驗(yàn)參考。
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