目前在國(guó)內(nèi)外報(bào)道中，對(duì)苯二氮卓類如 和非苯二氮卓類如*、*、扎 來(lái)普隆檢測(cè)的報(bào)道不少，但對(duì)于*、、氯、diclazepam 等新型的相關(guān) 報(bào)道很少，而且同時(shí)測(cè)定上述 10 中的方法未 見報(bào)道。對(duì)于上述新型已有的報(bào)道，大多是 氣相色譜法（GC）、氣質(zhì)聯(lián)用法（GC/MS）、高效 液相色譜法（HPLC）等。上述這些檢測(cè)方法中， HPLC 和 GC 靈敏度低同時(shí)都無(wú)法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確的定性。而 GC/MS 和 HPLC，GC 相比，靈敏 度高，同時(shí)能對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量，但是很多 藥物結(jié)構(gòu)相似，無(wú)法進(jìn)行分離，需要對(duì)藥物進(jìn)行衍 生化處理，整個(gè)過(guò)程較繁瑣；而 HPLC-MS/MS 靈敏 度高、準(zhǔn)確度高、檢出限低、可以同時(shí)對(duì)多種物質(zhì) 進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。
1 材料與方法
1.1 試劑與儀器 Biotage EXPRESS ABN 固相萃取柱 （60mg/3mL）；ABSCIEX QTRAP 6500 液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó) AB 公司；全自動(dòng)固相萃取儀（拜泰齊貿(mào)易上海有限公司）；5430R 離心機(jī)，德國(guó) EPPENDORF 公司；VORTEX-5 渦旋混合器，海門其林貝爾公司；微量移液器，德國(guó) EPPENDORF。 Diclazepam(1.0mg/mL)、（1.0mg/mL)、7- 氨基（1.0mg/mL)、*（1.0mg/mL)、 （1.0mg/mL)、 扎 來(lái) 普 隆（1.0mg/mL)、 佐 匹 克 ?。?.0mg/mL)、 （1.0mg/mL)、 *（100µg/mL)、氯（1.0mg/mL) 和 Diazepam-D5（100µg/mL)（均購(gòu)自上海安譜科學(xué)儀 器有限公司）。
1.2 溶液配制 精密移取各對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)（Diazepam-D5）適量， 分別以甲醇配制成各對(duì)照品濃度均為 10μg/mL 的混 合標(biāo)準(zhǔn)溶液和 0.2μg/mL 的內(nèi)標(biāo)工作液。
1.3 血液樣品處理 精密移取全血樣品 1mL，加入 50ngDiazepam-D5， 混勻，過(guò)固相萃取小柱（ABN 柱），再加入 2mL 水 洗脫，固相萃取小柱盡量吹干后，用1mL甲醇洗脫（除 步取血 1mL 外，后續(xù)過(guò)程由全自動(dòng)固相萃取儀 完成），取洗脫液 5μL 供 LC-MS/MS 分析。
1.4 色譜及質(zhì)譜條件 色譜條件 色譜柱：kinetex 2.6µC18(50m×3.0mm)； 柱溫：30℃；流速：0.4mL/min；進(jìn)樣量：5µL；流 動(dòng)相 A：10mmol/L 甲酸銨水溶液；流動(dòng)相 B：乙 腈； 梯 度 洗 脫 程 序：0~1min，98% A；1~10min，98%~0%A；10~13min，0% A；13~13.1min，0%~98% A； 13.1~15.5min，98% A。
2 結(jié)果
2.1 方法的專屬性 取空白全血添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成 100ng/ mL 的添加血。按 1.3 方法進(jìn)行樣品處理，按 1.4 的 色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，得到 10 種及內(nèi)標(biāo) 的總離子流圖，見圖 1，同時(shí)選取了部分的 MRM 圖，見圖 2。結(jié)果表明該方法可將 10 種及內(nèi)標(biāo)較好的進(jìn)行分離，藥物相互之間不影響測(cè) 定。
2.2 工作曲線和檢測(cè)限 取空白全血添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制成 0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、25、50、100、250 和 500ng/mL 的添加血。按 1.3 方法進(jìn)行樣品處理，按 1.4 的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，根據(jù)各種的 保留時(shí)間和碎片離子定性，以色譜峰面積進(jìn)行定量， 以信噪比 S/N≥3 作為檢出限，以信噪比 S/N≥10 作 為定量限，以各被測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，以被測(cè) 物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行加權(quán)（W=1/x） 最小二乘法回歸運(yùn)算。
3 討論 十種中，、、7- 氨基 都屬于第三代鎮(zhèn)靜，結(jié)構(gòu)比較相似， 保留時(shí)間比較接近，為了能使十種能夠* 分離，綜合分離度、峰形等相關(guān)因素，選擇梯度洗 脫程序進(jìn)行方法研究。十種都含有氮原子，在電噴霧離子源（ESI）電離下氮原子易得到一個(gè)質(zhì) 子，形成 [M+H]+ 離子態(tài)。因此由理論分析可知在 ESI+ 離子化模式下進(jìn)行全掃描比在 ESI- 離子模式 下靈敏度更高，因此采用電噴霧離子源（ESI）正離 子模式。在電噴霧離子源（ESI）電離下氮原子易得到一個(gè)質(zhì) 子，形成 [M+H]+ 離子態(tài)。因此由理論分析可知在 ESI+ 離子化模式下進(jìn)行全掃描比在 ESI- 離子模式 下靈敏度更高，因此采用電噴霧離子源（ESI）正離 子模式。
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