上海瓦克儀器有限公司
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閱讀：565發(fā)布時間：2025-10-16
常見的定量分析方法分為面積歸一化法、內(nèi)標法、外標法等。色譜分析的重要作用之一是對樣品定量，而色譜法定量的依據(jù)是組分重量或在載氣中濃度與檢測器的響應(yīng)信號成正比。
從定義上來區(qū)分，外標法就是用標準品的峰面積或峰高與其對應(yīng)的濃度做一條標準曲線，測出樣品的峰面積或峰高，在標準曲線上查出其對應(yīng)的濃度，這是的一種定量方法；內(nèi)標法是對應(yīng)外標法說的，是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標物，加入到準確稱量的試樣中，根據(jù)被測試樣和內(nèi)標物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色譜峰面積之比，來計算被測組分的含量。
以內(nèi)標法為例，選一與欲測組分相近但能分離的組分做內(nèi)標物(當然是樣品中沒有的組分)，然后配制欲測組分和內(nèi)標物的混合標準溶液，進樣得相對校正因子。再將內(nèi)標物加入欲測組分的樣品中，進樣后測得欲測組分和內(nèi)標物的定量參數(shù)，用內(nèi)標法公式計算即可。
外標法需用樣品和標準品對比，但是有時很難保證樣品和標準品進的體積是一樣的，畢竟要有誤差，這時就用內(nèi)標法，就是在外標法的基礎(chǔ)上，在樣品和標準品里在加入一種物質(zhì)，通過加入物質(zhì)的峰面積或峰高的變化，就可以看出標準品和樣品進樣體積的差別，但同時會引起加入物質(zhì)的秤量誤差。所以一般用外標法來定量，如果進樣體積很難掌握，就用內(nèi)標法，可以消除進樣體積的誤差。
外標法
(標準曲線法、直接比較法)
? 需要標樣；
? 目標組分被檢測到就可定量；
? 進樣量的誤差直接影響定量結(jié)果。
1、用欲測組分的標準樣品繪制標準工作曲線
用標準樣品配制成不同濃度的標準系列，在與欲測組分相同的色譜條件下，等體積準確量進樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標準工作曲線，此標準工作曲線應(yīng)是通過原點的直線。若標準工作曲線不通過原點，說明測定方法存在系統(tǒng)誤差。標準工作曲線的斜率即為校正因子。當欲測組分含量變化不大，并已知這一組分的大概含量時，也可不必繪制標準工作曲線，而用單點校正法，即直接比較法定量。單點校正法實際上是利用原點作為標準工作曲線上的另一個點。因此，當方法存在系統(tǒng)誤差時(即標準工作曲線不通過原點)，單點校正法的誤差較大。因此規(guī)定，y=ax+b，b的值應(yīng)不大于99%響應(yīng)值是y的2%。
2、標準曲線法的優(yōu)點
繪制好標準工作曲線后測定工作就很簡單，計算時可直接從標準工作曲線上讀出含量，這對大量樣品分析十分合適。特別是標準工作曲線繪制后可使用一段時間，在此段時間內(nèi)可經(jīng)常用一個標準樣品對標準工作曲線進行單點校正，以確定該標準工作曲線是否還可使用。
3、標準曲線法的缺點
每次樣品分析的色譜條件(檢測器的響應(yīng)性能、柱溫度、流動相流速及組成、進樣量、柱效等)很難相同，因此容易出現(xiàn)較大誤差。另外，標準工作曲線繪制時，一般使用欲測組分的標準樣品(或已知準確含量的樣品)，因此對樣品前處理過程中欲測組分的變化無法進行補償。
內(nèi)標法
組分A 的濃度為未知樣中的內(nèi)標濃度：100ppm X 濃度比0.58 = 58ppm
1、選擇合適的內(nèi)標物
選擇適宜的物質(zhì)作為欲測組分的參比物，定量加到樣品中去，依據(jù)欲測組分和參比物在檢測器上的響應(yīng)值(峰面積或峰高)之比和參比物加入的量進行定量分析的方法稱為內(nèi)標法。內(nèi)標法的關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標物。內(nèi)標物應(yīng)是原樣品中不存在的純物質(zhì)，該物質(zhì)的性質(zhì)應(yīng)盡可能與欲測組分相近，不與被測樣品起化學反應(yīng)，同時要能溶于被測樣品中。內(nèi)標物的峰應(yīng)盡可能接近欲測組分的峰，或位于幾個欲測組分的峰中間，但必須與樣品中的所有峰不重疊，即分開。
2、內(nèi)標法的優(yōu)點
進樣量的變化，色譜條件的微小變化對內(nèi)標法定量結(jié)果的影響不大，特別是在樣品前處理(如濃縮、萃取、衍生化等)前加入內(nèi)標物，然后再進行前處理時，可部分補償欲測組分在樣品前處理時的損失。若要獲得很高精度的結(jié)果時，可以加入數(shù)種內(nèi)標物，以提高定量分析的精度。
3、內(nèi)標法的缺點
選擇合適的內(nèi)標物比較困難，內(nèi)標物的稱量要準確，操作較麻煩。使用內(nèi)標法定量時要測量欲測組分和內(nèi)標物的兩個峰的峰面積(或峰高)，根據(jù)誤差疊加原理，內(nèi)標法定量的誤差中，由于峰面積測量引起的誤差是標準曲線法定量的2-2是由于進樣量的變化和色譜條件變化引起的誤差，內(nèi)標法比標準曲線法要小很多，所以，總的來說，內(nèi)標法定量比標準曲線法定量的準確度和精密度都要好。
標準加入法
Added Pb Concentration(ppm)
1、標準加入法的實質(zhì)意義
標準加入法實質(zhì)上是一種特殊的內(nèi)標法，是在選擇不到合適的內(nèi)標物時，以欲測組分的純物質(zhì)為內(nèi)標物，加入到待測樣品中，然后在相同的色譜條件下，測定加入欲測組分純物質(zhì)前后欲測組分的峰面積(或峰高)，從而計算欲測組分在樣品中的含量的方法。
2、標準加入法的優(yōu)點
不需要另外的標準物質(zhì)作內(nèi)標物，只需欲測組分的純物質(zhì)，進樣量不必十分準確，操作簡單。若在樣品的前處理之前就加入已知準確量的欲測組分，則可補償欲測組分在前處理過程中的損失，是色譜分析中較常用的定量分析方法。
3、標準加入法的缺點
要求加入欲測組分前后兩次色譜測定的色譜條件相同，以保證兩次測定時的校正因子相等，否則將引起分析測定的誤差。
4、選擇內(nèi)標物有要求
? 內(nèi)標物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì)；
? 它必須溶于試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能分離；
? 加入內(nèi)標物的量應(yīng)接近于被測組分；
? 色譜峰的位置應(yīng)與被測組分的色譜峰的位置相近，或在幾個被測組分色譜峰中間。
案例應(yīng)用
內(nèi)標法的優(yōu)點是測定的結(jié)果較為準確，由于通過測量內(nèi)標物及被測組分的峰面積的相對值來進行計算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差；缺點是操作程序較為麻煩，每次分析時內(nèi)標物和試樣都要準確稱量，有時尋找合適的內(nèi)標物也有困難。
外標法簡便，但進樣量要求十分準確，要嚴格控制在與標準物相同的操作條件下進行，否則造成分析誤差，得不到準確的測量結(jié)果。內(nèi)標與外標都是定量的一種方法而已，至于哪一種方法好與不好不能一概而論，做不同的分析，面對不同的要求，再加上分析成本分析效率等等問題，想簡單而有效進行定量分析來滿足要求才是最重要的。
? 案例1
很多醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析，沒有自動進樣器，用外標法定量，確實重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差，結(jié)果經(jīng)常受到質(zhì)疑。其實，仔細分析原因不一定就是外標法不適合這種定量分析。
首先，實驗室儀器和手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)，比如襯管是否潔凈，的位置是否合適恰當(能否使樣品盡可能的汽化)、汽化溫度是否合適、色譜峰形是否對稱(也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配)、附近有沒有其它色譜峰的干擾、選用什么進樣方式(如快速進樣還是熱針進樣)等等因素的影響都需要考慮。
如果以上這些因素都考慮了，按照GMP方法驗證對于精密度的要求，同一樣品進6針以上的RSD和配制6個樣品的定量結(jié)果RSD都能滿足小于1.5%的要求，那么，這個方法用外標法就是適用的，但前面的影響因素是一定都要考慮到的，否則談?wù)撨@個方法是否適用就有失偏頗了。
許多出口產(chǎn)品的定量分析方法當中有許多是一些醫(yī)藥公司提供的比較*而驗證過的方法，內(nèi)標與外標都有(用的都是自動進樣)精密度都能滿足RSD小于1.5%的要求，當一個方法能夠滿足測試要求時，無論內(nèi)標外標都是可行的。當然有一個分析成本和分析時間的問題，內(nèi)標的成本和控制溶液、樣品溶液的配制要比外標要高和麻煩一些。而有時可能受實驗室現(xiàn)有儀器和附屬設(shè)備的影響，達不到一定的要求而還必須進行定量分析，有時外標的結(jié)果可能就要差一些，這時，可能就要考慮用內(nèi)標法了，可排除手動進樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響，這時內(nèi)標就顯示出它的優(yōu)勢了。
? 案例2
上面已經(jīng)提到，在做方法驗證時，當同一樣品配制6個樣品溶液用所選用的外標法進行定量的時候，RSD都滿足1.5%的要求時也分為兩種情況：＜1%和＞1%＜1.5%。
如果RSD的結(jié)果＜1%，那這個方法就沒有什么可懷疑的了；如果RSD的結(jié)果＞1%而在1.5%略低一些的范圍活動時，這個方法的可行性就將受到質(zhì)疑，畢竟這是方法驗證，那就要考慮案例1所提到的影響因素，如果排除掉以上的影響因素，RSD還是在1.5%附近，就要嘗試內(nèi)標了，如果內(nèi)標結(jié)果的RSD很好，就證明這個方法受實驗條件的影響很大，只能用內(nèi)標或干脆將原方法做大的變動，再嘗試用外標法測試。
? 案例3
對于微量分析，比如農(nóng)藥和獸藥殘留的分析、環(huán)境分析等，根據(jù)不同的標準要求對于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松的多，RSD有時可允許達到10%甚至更高，這時可能外標法有更大的應(yīng)用空間。
? 案例4
單從精密度方面去考慮，排除其它成本和效率的因素，還是內(nèi)標優(yōu)于外標。
如一個中間體二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺為內(nèi)標，RTX-5amine(堿改性)15m*0.32mm*1.0um色譜柱分析，將配制好的控制溶液(含有內(nèi)標物)自動進樣器進6針，目的物(二氨基丙醇)與內(nèi)標物(二乙醇胺)峰面積比率的RSD為0.18%，而只對這六針樣品的目的物峰(二氨基丙醇)面積求RSD，結(jié)果為0.71%。
通過這一實例的結(jié)果就會發(fā)現(xiàn)，內(nèi)標法精密度更好。當然，這個化合物的檢測方法最后根據(jù)上面的驗證數(shù)據(jù)，用內(nèi)標和外標定量都是可以的，實驗室可以自由選擇。但內(nèi)標與外標精密度結(jié)果的差異是顯然存在的事實。
綜上所述，如果應(yīng)用外標法能夠滿足要求的話，當然還是外標法，畢竟簡單而省事。對于精密度要求比較高、結(jié)果準確度會產(chǎn)生重大影響、實驗室條件不是很理想的等等條件下，用內(nèi)標法還是必要的。
但無論應(yīng)用那種方法，方法的驗證和確認都是很重要的，只要是按照程序經(jīng)過驗證和確認的方法，都有其應(yīng)用的空間的。
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