在蘭州液相色譜儀是屬于易學(xué)難用的儀器，特別講究“正確使用"和經(jīng)驗。液相工作者接觸較多的是流動相，也就是流動相，是造成蘭州液相色譜各種問題的主要源頭。液相色譜儀常見的故障之一是堵接下來先聊聊“堵"的情況。“堵"的表現(xiàn)現(xiàn)象就是柱壓異常升高，直接原因就是流路不暢。堵塞的主要位置就是在色譜柱的前端，其主要原因就是流動相里有雜質(zhì)，雜質(zhì)的主要來源就是細菌。“堵"的原因之一：配制流動相時細菌污染首先，我們要認識到，一般的國產(chǎn)甲醇其實不需要額外過濾處理，直接使用沒有問題。即使是有些固態(tài)微粒雜質(zhì)，也能在液相流路系統(tǒng)前端的過濾頭上排除，真正容易引起問題的，是水中的細菌。新制備的純水在室內(nèi)放置幾天就會長菌，而這些細菌雖然肉眼不可見，卻足以堵塞柱填料顆粒的空隙，造成柱子很快報廢。這就是在配制流動相時造成的細菌污染的原因，解決它的方法很簡單，就是確保水的可靠性。這里有兩種方式推薦：（1）理想的方式當(dāng)然是購買實驗室專用純水機，既方便又可靠，質(zhì)量也放心。其有一個缺點就是價格不菲。（2）成箱購買市售品牌純凈水，如，500mL一支的怡寶或娃哈哈，這些水的質(zhì)量足以應(yīng)付液相色譜的要求。先隨機抽取一支做一下細菌平板實驗，待菌落數(shù)合格方可使用。這樣每次只要單獨開一支即可，也很方便。每次成本2元左右。※這里特別指出一個細節(jié)：在絕大多數(shù)書本上，凡談到配制流動相都會談到后來有一個過濾的步驟。但是從我們長期使用的實際效果來說，只要能保證水的質(zhì)量，這一步可以也應(yīng)當(dāng)去除。原因有以下三點：（1）流動相過濾在理論上有好處，但是，實際操作時由于不可能做到專瓶專用，反而容易造成的交叉污染，對于配比復(fù)雜的流動相影響更大。（2）流動相過濾在經(jīng)濟成本上不劃算。買一套過濾裝置要6000多元，且過濾器*是比較容易損壞的設(shè)備。重要是過濾片的成本太高，一片就要幾十元。按一般液相柱的正常使用壽命計算，過濾片的成本會遠遠高于色譜柱的成本。（3）流動相過濾對于工作效率成本不劃算。使用溶劑過濾器有一個預(yù)清洗、裝備、使用、用后清洗，晾干的過程，至少也有一個小時的時間。這個成本也不能忽視。（4）在實際工作未發(fā)現(xiàn)流動相不過濾會對柱壽命有任何影響。我們起碼有6年時間沒有做過流動相過濾的工作，但是和國內(nèi)同行相比較，在同等使用強度下我們的柱壽命是比較長的。“堵"的原因之二：使用流動相時的細菌污染。指的是：流動相剛開始沒有長菌，在使用時卻產(chǎn)生了細菌污染。這主要是在使用多元液相色譜儀時的一種不良使用習(xí)慣造成的。舉個簡單的例子：50％的甲醇水流動相，有兩種使用方式。一種方式是在上機前就配好混合在一起，另一種方式是在流路A放純甲醇，流路B放純水。從單純實驗效果來說，后一種有明顯的優(yōu)點：首先是簡單，不需要實驗者另個計算配比混合，其次就是比例準(zhǔn)確，能得到保留時間重復(fù)性好的實驗效果。但是，它有一個致命的缺陷，就是純水在流動相瓶中幾天時間就會長細菌（很多情況下不僅僅用純水作流動相，而是用緩沖鹽溶液，本身就是很好的肥料，細菌長得更迅速），一旦有細菌柱子就壞得很快。所以這種方式要求操作人員每次實驗都要用新制備的純水，更要求在每次實驗后把水相換掉，換成甲醇沖洗干凈，這一點在實際工作中很多人意識不強，就是意識到了但多次使用中總有一兩次會遺漏，但是往往這一兩次就足以產(chǎn)生致命的影響。因為液相色譜柱的堵塞是不可逆的。所以，寧可犧牲小小的保留時間的重復(fù)性，也不要用純水溶液作為流動相的一組。從實際實驗效果來說，我建議用10％的甲醇水代替純水溶液（以前我做過不同比例甲醇水的細菌總數(shù)實驗，在5％就基本可以了，在10％及以上就可以了），這樣可以有效排除長細菌的隱患，既可作流動相，也可沖柱。就算是在配制流動相時會計算得麻煩一些，但是一次麻煩，終身受益。“堵"的原因之三：不適當(dāng)操作。常見問題的有以下幾種：（1）在更換零件時選擇的型號有誤，接口不是很匹配，在擰緊的時候產(chǎn)生變形而使得管路堵塞。（2）樣品處理液凈化得不干凈，長期會在六通閥和柱之間形成阻塞不暢。（3）在使用手動六通閥時，有些人可能由于手勁小的原因，轉(zhuǎn)動的不到位，于是造成流路形成了死堵，壓力快速升高超過警戒值。（4）在使用金屬管路作出廢液管時，應(yīng)當(dāng)注意在廢液瓶中先放一些水，并把廢液管的出口端放在液面下。如果位于在液相上且實驗使用較高濃度的緩沖鹽溶液，在停機時可能在出口端結(jié)晶成塊并造成堵塞。這種情況不常見，但卻的確發(fā)生過。“堵"的原因講了不少，現(xiàn)介紹查堵的方法。在發(fā)生“堵"的現(xiàn)象后，就需要找出原因，主要是什么位置發(fā)生了“堵"。注意，絕大多數(shù)情況下，整個系統(tǒng)只會有一個地方發(fā)生堵塞。查堵的方法是從尾向前逆向分段拆開，仔細觀察壓力數(shù)值，如果某一個部件（柱子除外）裝上和拆下時的壓力差別很大，可發(fā)展變化判斷。至于柱的堵塞，可以通過換同樣規(guī)格的柱的壓力是否一致來判斷。1.流動相須用HPLC級的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45μm或更細的膜過濾)。 2.流動相過濾后要脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。3.不能用純乙腈作為流動相，這樣會使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進液。4.使用緩沖溶液時，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時，然后用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對于柱塞桿外部，做完樣品后也須用去離子水沖洗20mL以上。5.長時間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機相(如，甲醇等)，因為，純水易長霉。6.每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑清洗進樣器。7.C18柱不能進蛋白樣品，血樣、生物樣品。8.堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱→混合器中的過濾器→管路過濾器→單向閥檢查并清洗，清洗方法：①以異丙醇作溶劑沖洗；②放在異丙醇中間用聲波清洗；③用10％稀硝酸清洗；9.氣泡會致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。10.如果進液管內(nèi)不進液體時，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進行流動相的清洗。11.要注意柱子的pH值范圍，不得注射強酸強堿的樣品，特別是堿性樣品。12.更換流動相時應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動邊靖洗，然后插入新的流動相中。更換無互溶性的流動相時要用異丙醇過渡一下。
常見故障斷定及解決方法(一)保留時間變化 1.柱溫變化：柱恒溫，需要時需配置恒溫箱2.等度與梯度間未能充分平衡：至少用10倍柱體積的流動相平衡柱3.緩沖液容量不夠：用》25mmol/L的緩沖液4.柱污染：每天沖洗柱5.柱內(nèi)條件變化：穩(wěn)定進樣條件,調(diào)節(jié)流動相6.柱快達到壽命：采用保護柱(二)保留時間縮短 1.流速增加：檢查泵,重新設(shè)定流速2.樣品超載：降低樣品量3.鍵合相流失：流動相pH值保持在3~7.5檢查柱的方向4.流動相組成變化：防止流動相蒸發(fā)或沉淀5.溫度增加：柱恒溫(三)保留時間延長 1.流速下降：管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡2.硅膠柱上活性點變化：用流動相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱3.鍵合相流失：同前(二)34.流動相組成變化：同前(二)45.溫度降低：同前(二)5(四) 出現(xiàn)肩峰或分* 1.樣品體積過大：用流動相配樣,總的樣品體積小于峰的15%2.樣品溶劑過強：采用較弱的樣品溶劑3.柱塌陷或形成短路通道：更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效：更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品5.進樣器損壞：更換進樣器轉(zhuǎn)子(五)鬼峰1.進樣閥殘余峰：每次用后用強溶劑清洗閥,改進閥和樣品的清洗2.樣品中未知物：處理樣品3.柱未平衡：重新平衡柱,用流動相作樣品溶劑 (尤其是離子對色譜)4.三(TFA)氧化(肽譜) ：每天新配5.水污染(反相) ：通過變化平衡時間檢查水質(zhì)量，用HPLC級的水(六) 基線噪聲 1.氣泡(尖銳峰) 流動相脫氣：加柱后背壓2.污染(隨機噪聲) ：清洗柱,凈化樣品,用HPLC級試劑3.檢測器燈連續(xù)噪聲：更換氘燈4.電干擾(偶然噪聲) ：采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來源(如水浴等)5.檢測器中有氣泡：流動相脫氣,加柱后背壓(七)峰拖尾 1.柱超載：降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相2.峰干擾：清潔樣品,調(diào)整流動相3.硅羥基作用：加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相PH值,鈍化樣品4.同前(四)4 同前(四)45.同前(四)3 5.同前(四)36.死體積或柱外體積過大：連接點降至低處,對所有連接點作合適調(diào)整,盡可能采用細內(nèi)徑的連接管7.柱效下降：用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護柱(八)峰展寬 1.進樣體積過大：同(四)12.在進樣閥中造成峰擴展L進樣前后排出氣泡以降低擴散3.數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢:設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點4.檢測器時間常數(shù)過大:設(shè)定時間常數(shù)為感興趣峰半寬的10%5.流動相粘度過高:增加柱溫,采用低粘度流動相6.檢測池體積過大:用小體積池,卸下熱交換器7.保留時間過長:等度洗脫時增加溶劑含量也可用梯度洗脫8.柱外體積過大:將連接管徑和連接管長度降至很小9.樣品過載:進小濃度小體積樣品
