[目的] 建立動(dòng)態(tài)濁度法定量測(cè)定人原復(fù)合物制品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法。
[方法] 通過對(duì)樣品中定量添加標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的干擾試驗(yàn)，檢測(cè)其回收率應(yīng)在50%～200%范圍。
[結(jié)果] 人原復(fù)合物制品對(duì)鱟試驗(yàn)無干擾作用，動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)結(jié)果與家兔實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。
[結(jié)論] 應(yīng)用本方法定量測(cè)定人原復(fù)合物制品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量是可行的。
關(guān)鍵詞： 人原復(fù)合物; 細(xì)菌內(nèi)毒素; 動(dòng)態(tài)濁度法; 鱟試驗(yàn)
人原復(fù)合物臨床上主要用于治療先天性和獲得性Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ缺乏癥[1-2]。依據(jù)2010年版《中國藥典》三部規(guī)定，人原復(fù)合物制品中熱原檢查是采用家兔法，但此法操作繁瑣，時(shí)間長且費(fèi)用高，不適用于制品的生產(chǎn)過程控制和成品的大規(guī)模熱原檢測(cè)，故需建立一種快速測(cè)定的方法，用于人原復(fù)合物生產(chǎn)過程中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的控制。筆者參閱了有關(guān)文獻(xiàn)[3-4]，初步建立了動(dòng)態(tài)濁度法定量測(cè)定人原復(fù)合物制品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法。
1 材料與方法
1.1 樣品和儀器
人原復(fù)合物(批號(hào)為20110610、20110711、20110712、20110713、20110714、20110815、20110816、20110919、 Test1、Test2、Test3，規(guī)格為300 IU/瓶);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(批號(hào)為1010130，規(guī)格為5 mL/支，湛江安度斯生物有限公司);動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑(批號(hào)為1010142，規(guī)格為1.25 mL/支，λ=0.03 EU/mL，湛江安度斯生物有限公司);細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為150601-201071，規(guī)格為90 EU/ 支，中國藥品生物制品檢定所)。Bioprobe—2002型細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀，XW-80A型旋渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)的確定 采用公式為：L=K/M，式中K為規(guī)定的給藥途徑，人每千克質(zhì)量每小時(shí)可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K=5 EU/(kg.h);M為每千克質(zhì)量每小時(shí)的給藥劑量為30 IU/(kg.h)。計(jì)算得樣品的內(nèi)毒素限值L為0.167 EU/IU。
1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及可靠性試驗(yàn) 用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET)水1 mL溶解細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，置漩渦混合器上混合15 min，然后逐級(jí)稀釋(每步不超過10倍)至最終細(xì)菌內(nèi)毒素濃度分別為2.00、0.25、0.03125 EU/mL,3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液各取0.10 mL，分別加到預(yù)先加有0.10 mL動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑的試管內(nèi)，混勻，立即插入Bioprobe—2002型細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀內(nèi)，37℃1 h自動(dòng)檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)3管，并同時(shí)做陰性對(duì)照2管。
1.2.3 干擾實(shí)驗(yàn)
?、?樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算:公式為MVD=LC/λ1，式中λ1為動(dòng)態(tài)濁度法標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)細(xì)菌內(nèi)毒素濃度0.03125 EU/mL;L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值0.167 EU/IU;C為10 IU/mL。計(jì)算得人原復(fù)合物有效稀釋倍數(shù)MVD為53倍。
?、?樣品溶液配制及干擾實(shí)驗(yàn):取人原復(fù)合物樣品(批號(hào)為20110610，規(guī)格為300 IU/mL)用30 mL水復(fù)溶，然后用BET水稀釋為5、10、20、40、50倍溶液，作為樣品溶液，記為Ai液。同時(shí)進(jìn)行同樣倍數(shù)稀釋，但在稀釋液中添加濃度為0.25 EU/mL或0.50 EU/mL的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，作為內(nèi)毒素陽性對(duì)照管，記為Bi液。分別吸取上述各液0.10 mL，加入預(yù)先加有0.10 mL動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑(TAL)的試管內(nèi)混勻，立即插入Bioprobe—2002型細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀內(nèi)自動(dòng)檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)3管，計(jì)算回收率?；厥章?%)=(Bi液內(nèi)毒素值-Ai液內(nèi)毒素值)/添加內(nèi)毒素濃度λ×99%。
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