【摘要】
目的 建立快速測定人血清中游離氨基酸的方法。方法 用高效毛細(xì)管電泳法檢測了40例健康人，32例腎病患者血清氨基酸。
結(jié)果 在8分鐘內(nèi)分離16種氨基酸，線性在10～700 µmol/L范圍，檢出限為2.5～7.9 µmol/L，回收率為86.3%～107.4%，批內(nèi)精密度為2.8%～10.3%，批間精密度為3.5%～11.6%。對32例腎臟病患者血清中氨基酸測定結(jié)果與40例正常人對照組氨基酸測定值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)論 高效毛細(xì)管電泳法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn)，為臨床及科研工作中測定氨基酸提供了一種有效的方法。
A rapid high performance capillary electrophoretic method for determination of free amino acids in serum Shen Zuojun*, Wu Lin. *National Center for Clinical Laboratory, Beijing Hospital Compound, Beijing 100730
【Abstract 】 Objective To develop a rapid assay for the determination of free amino acids (AAs) in serum. Methods The assay was based on precolumn derivatization of AAs and internal standard with 2,4-dinitrofluorobenzen(DNFB), separation of the derivatives by high performance capillary electrophoresis (HPCE), and quantification by ultraviolet detection. Results The complete separation of 16 kinds of AAs was achieved within 8 min. The assay was linear from 10 to 700 ?mol/L. The minimal detection limit was 2.5～7.9 ?mol/L. The recovery of AAs added to serum samples was 86.3%～107.4%. Within-run precision was 2.8%～10.3%, and between-run precision was 3.5%～11.6%. The AAs concentrations in serum of 32 patients with chronic renal failure were measured. Among them, the levels of serine, isoleucine and valine were significantly lower than those of healthy volunteers (P<0.01), but the amounts of cystine, tryptophan and phenylanine were significantly higher than those of healthy volunteers (P<0.01). Conclusions HPCE has many advantages such as rapidity, simplicity, accuracy and sensitivity. The method can be used for determining AAs in clinical practice and scientific research.
【Key words 】 Amino acids D-Norleucine 2,4-Dinitrofluorobenzen Electrophoresis
在臨床上，氨基酸測定不僅對遺傳代謝性疾病、腎病、肝病的診斷和治療具有重要的價(jià)值［1］，而且近年來在評(píng)價(jià)病人營養(yǎng)狀況方面亦受到廣泛重視［2］。為研究不同疾病狀態(tài)下氨基酸的代謝情況［3，4］，需要一種快速測定氨基酸的方法來滿足大批量樣品檢測的需要。氨基酸分析常用的離子交換色譜法和反相高效液相色譜法因其成本高且費(fèi)時(shí)而難以普及。相比之下，發(fā)展起來的高效毛細(xì)管電泳法以其快速、簡便、準(zhǔn)確、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)備受青睞，為快速測定氨基酸提供了有效手段。作者采用高效毛細(xì)管電泳法，建立了快速檢測人血清中游離氨基酸的方法，經(jīng)實(shí)際應(yīng)用獲得滿意效果。 材料與方法 一、儀器
1.高效毛細(xì)管電泳儀：P/ACE 5500型，美國BECKMAN公司生產(chǎn)。
2.pH計(jì)：ORION 520A。
3.石英毛細(xì)管：內(nèi)徑75 µm，河北永年光導(dǎo)纖維廠生產(chǎn)。
二、試劑
1.16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物、D-正白氨酸、2，4-二硝基氟苯(DNFB)、30%Brij35為美國Sigma公司生產(chǎn)。
2.0.5 mol/L pH 9.5四硼酸鈉緩沖液、0.03 mol/L pH 9.8硼酸鈉緩沖液自配。 圖1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的毛細(xì)管電泳分離圖譜 圖2 人體血清中游離氨基酸的毛細(xì)管電泳圖譜 3.乙腈為色譜純、異丙醇為AR級(jí)。
三、方法
1.標(biāo)本采集與處理：取空腹血液3 ml，離心后取血清1 ml，加內(nèi)標(biāo)(10 mmol/L D-正白氨酸)20 µl，加乙腈1 ml，混勻，離心去蛋白，上清液備用。不能及時(shí)分析的樣品需-20℃冷凍保存。
2.衍生化方法：(1)衍生化反應(yīng)原理：在堿性條件下，氨基酸中的氨基能定量地與DNFB反應(yīng)生成氨基酸衍生化產(chǎn)物，在360 nm處有吸收，紫外檢測定量。(2)衍生化步驟：取尖底帶蓋玻管，加0.5 mol/L pH 9.5硼酸鈉緩沖液1 ml，乙腈1 ml，待測標(biāo)本的上清液或氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液1 ml，DNFB 20 ?l，混勻，至50℃水浴40分鐘。
3.分離條件：(1)操作緩沖液的組成：0.03 mol/L pH 9.8四硼酸鈉緩沖液：異丙醇：30% Brij35=825∶150∶25。(2)開口石英毛細(xì)管：總長度為370 mm，有效長度為300 mm，內(nèi)徑為75 µm。(3)電壓：28 kV。(4)溫度：15℃。(5)進(jìn)樣：壓力進(jìn)樣5秒。
4.結(jié)果計(jì)算：將16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成10、50、100、300、500和700 µmol/L 6個(gè)不同濃度，測定后以氨基酸濃度( ?mol/L)為橫坐標(biāo)，峰高響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測樣品的峰高響應(yīng)值查表即得樣品的氨基酸含量。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一、氨基酸的分離
1.氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的分離：將16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液，其中(Arg)、(Tyr)、賴氨酸(Lys)、(Trp)、(His)、苯(Phe)、異(Ile)、(Leu)、蛋氨酸(Met)、(Val)、(Ser)、(Thr)、(Pro)、(Ala)、(Gly)各為100 µmol/L，(Cys)為50 µmol/L，內(nèi)標(biāo)(IS)為200 µmol/L進(jìn)行衍生化反應(yīng)，然后電泳分離。由圖1可見16種氨基酸和內(nèi)標(biāo)在8分鐘內(nèi)達(dá)到分離。
2.人體血清中游離氨基酸的分離：人血清標(biāo)本經(jīng)乙腈去蛋白后衍生化反應(yīng)，直接進(jìn)樣分析。由圖2可知，血清中其它成分對所要測定的氨基酸無明顯的干擾。
二、線性范圍
將16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成10、50、100、300、500和700 µmol/L 6個(gè)不同濃度，測定后進(jìn)行線性回歸，計(jì)算其相關(guān)系數(shù)r在0.964～0.995之間。結(jié)果表明16種氨基酸在10～700 µmol/L范圍內(nèi)線性良好。
三、精密度
取一份正常人血清標(biāo)本，分別做批內(nèi)和批間誤差測定。批內(nèi)測定時(shí)，同一份樣本同時(shí)測12份，作為批內(nèi)精密度觀察指標(biāo)，結(jié)果氨基酸測定變異系數(shù)在2.8%～10.3%之間；批間測定時(shí)，不同時(shí)間共測10批，作為批間精密度觀察指標(biāo)，結(jié)果氨基酸測定變異系數(shù)在3.5%～11.6%之間。
四、檢測限
計(jì)算基線噪音相應(yīng)于信噪比為2 (S/N=2)時(shí)的濃度即為檢測限，在2.5～7.9 µmol/L之間。
五、回收率
取一份正常人血清標(biāo)本，分別加入50 µmol/L和200 µmol/L兩種濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液，測得平均回收率在86.3%～107.4%之間。
六、參考值
用本法對40名健康人血清中16種游離氨基酸進(jìn)行參考值調(diào)查，其中男性20名，年齡16～58歲；女性20名，年齡17～62歲。血清氨基酸含量見附表。 附表 正常人和腎病患者組16種血清氨基酸測定結(jié)果的比較( ±s,µmol/L) | 氨基酸名稱 | 正常人組(n=40) | 腎病患者組(n=32) | | 108.3±30.4 | 104.7±28.3 | | 65.8±12.7 | 54.2±10.6 | | 賴氨酸 | 209.1±38.5 | 197.5±43.2 | | 35.2±7.6 | 94.8±26.7* | | 81.4±11.3 | 86.5±29.1 | | 苯 | 61.5±8.2 | 94.8±23.7* | | 異 | 94.8±43.6 | 41.3±18.5* | | 124.7±30.5 | 115.2±27.6 | | 21.3±8.4 | 274.3±76.4* | | 蛋氨酸 | 31.3±7.4 | 35.2±10.5 | | 249.8±41.5 | 181.9±78.6* | | 127.4±35.8 | 48.3±20.5* | | 119.2±28.0 | 121.4±30.7 | | 205.3±58.4 | 230.1±63.5 | | 406.7±81.3 | 382.4±84.7 | | 238.0±51.4 | 259.6±62.3 |
七、臨床應(yīng)用
用本法測定32例腎臟病患者血清游離氨基酸，其中男性15例，年齡34～56歲，女性17例，年齡29～51歲。測定結(jié)果與正常人比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(均數(shù)t檢驗(yàn))，發(fā)現(xiàn)該類患者的、異和明顯低于正常人(P<0.01)；而、和苯明顯高于正常人(P<0.01)，尤以顯著，見附表。 討論 1.氨基酸傳統(tǒng)分析方法為離子交換色譜法［5］，該法操作繁瑣，成本高，費(fèi)時(shí)，一次分析常需數(shù)小時(shí)之久。目前氨基酸測定方法多用反相高效液相色譜法［6，7］，該法雖較傳統(tǒng)法有較大改進(jìn)，但仍有明顯不足，一次分析周期常需一小時(shí)左右，成本也較高。高效毛細(xì)管電泳法是近幾年才發(fā)展起來的新技術(shù)，其分離效能高，快速，試劑消耗量少，是一種十分有效的分離方法。我們對分離條件和衍生化反應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)探索，結(jié)果無論是分離效果還是分離時(shí)間均明顯優(yōu)于國外報(bào)道的同類方法［8，9］。
2.由于大多數(shù)氨基酸本身不具有紫外吸收，也不發(fā)射熒光，因此，需制成能夠被檢測的衍生物才能進(jìn)行測定。氨基酸的衍生化方法有多種，的為鄰苯二甲醛法［10］，但該法不夠穩(wěn)定，且不能與二級(jí)氨基反應(yīng)。本研究采用的2，4-二硝基氟苯法最初被用來進(jìn)行氨基酸的測序［11］，該法穩(wěn)定、摩爾吸光系數(shù)大、且能與二級(jí)氨基反應(yīng)。其不足之處是與的衍生化反應(yīng)較慢。
3.本分離方法是采用區(qū)帶毛細(xì)管電泳法，在操作緩沖液中，我們加入了異丙醇作為有機(jī)改性劑，提高選擇性，使分離效果得到明顯改善。同時(shí)還加入表面活性劑Brij35，不僅提高了氨基酸測定的分離度，而且顯著縮短分析時(shí)間。
4.本研究旨在建立血清中氨基酸分析方法，故標(biāo)本要經(jīng)過去蛋白處理步驟，由此可能造成待測組份的損耗。為消除此影響，我們選擇了D-正白氨酸作內(nèi)標(biāo)，取得了滿意的效果，方法的各項(xiàng)性能指標(biāo)均優(yōu)于外標(biāo)法。 參考文獻(xiàn) 1Rattenbury JM. Amino acid analysis. First Aed. England: Ellis Horwood Ltd, 1981, 257-268.
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