威尼德生物科技（北京）有限公司
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閱讀：24發(fā)布時間：2026-5-22
威尼德生物科技（北京）有限公司，研發(fā)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)型分子雜交儀VH-1000、多功能型分子雜交儀VH-4000、組合型分子雜交儀VH-2000，底部標(biāo)配培養(yǎng)皿圓周運(yùn)動托盤，選配250ML/500ML錐形瓶托盤， 96孔酶標(biāo)板托盤，可適用于如放置雜交袋等其他嚴(yán)格要求的孵育實(shí)驗(yàn)，，以及膜洗脫和凝膠脫色，同時可以做恒溫微生物培養(yǎng)。分子雜交儀是現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室采用雜交技術(shù)的理想設(shè)備，可替代塑料雜交袋和水浴搖床，并避免破損帶來的污染危害。
Q1: PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？
A1:一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，若反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來，效果較差。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合（注：常用的PVDF膜即帶正電荷的尼龍膜），同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，效果較好。
Q2:做組織樣品的western blot的時候，處理樣品有什么訣竅？
A2: 進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意蛋白酶的活性（加入PMSF和蛋白酶劑），封閉劑一般5％脫脂奶粉。如果一抗為多克隆抗體，使用BSA也是不錯的選擇
Q3:免疫組化和Western blot可以用同一種抗體嗎？
A3: 免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western blotting，而如果抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區(qū)間。（限于單抗）
Q4: 不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上， 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？
A4: 可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20％甲醇（是指終濃度）(優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液，可以參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》)，因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1％SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低至6％。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓／電流；增加轉(zhuǎn)移時間。
威尼德生物科技（北京）有限公司，研發(fā)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)型分子雜交儀VH-1000、多功能型分子雜交儀VH-4000、組合型分子雜交儀VH-2000，底部標(biāo)配培養(yǎng)皿圓周運(yùn)動托盤，選配250ML/500ML錐形瓶托盤， 96孔酶標(biāo)板托盤，可適用于如放置雜交袋等其他嚴(yán)格要求的孵育實(shí)驗(yàn)，，以及膜洗脫和凝膠脫色，同時可以做恒溫微生物培養(yǎng)。分子雜交儀是現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室采用雜交技術(shù)的理想設(shè)備，可替代塑料雜交袋和水浴搖床，并避免破損帶來的污染危害。
Q5:Western blot哪種染色好？
A5: (1）陰離子染料是常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測可達(dá)到 1.5μg，考馬斯亮藍(lán)雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質(zhì)中除去，以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。缺點(diǎn)是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會引起硝化纖維素膜的皺縮或破壞，不能用于帶正電荷的膜。靈敏度低。
(2）膠體金，靈敏度高，檢測范圍可到pg級，但染色比較穩(wěn)定。
（3）化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。
Q6: 用Western檢測基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達(dá)的目的蛋白（定性），分子量為20KD，濃度約為幾百ng/ml。蛋白樣品是否需濃縮、純化？如何濃縮、純化上清液中的目的蛋白？對小分子蛋白Western blot時需特別注意哪些條件？
A6：按照提供的濃度，如果做Western blot，是不用濃縮樣品的. 對于20kd的小分子的蛋白，Western Blot中要注意的是：
1、轉(zhuǎn)移時的時間，
2、轉(zhuǎn)移時的電流或電壓.
3、transfer buffer 中加20％的甲醇.
4、可以用13-15％的分離膠.
Q7: 半干法轉(zhuǎn)移與膠的面積和蛋白分子兩大小有一定關(guān)系，那么濕法轉(zhuǎn)移是不是所有的轉(zhuǎn)移條件都一樣呢？一般的條件是怎樣的？
A7：半干轉(zhuǎn)的電流大小是按照面積來算的，時間是根據(jù)蛋白分子大小定的；而濕轉(zhuǎn)的話電流是恒定的，時間也是根據(jù)分子量而定。
Q8: 采用標(biāo)記的二抗-SABC-DAB檢測系統(tǒng)做western，非特異性的條帶和背景很高，總蛋白考染的時候發(fā)現(xiàn)接近積層膠的條帶比較清楚，條帶也很窄，可是越靠下面的條帶越來越寬，有的跑得都連在一起，這是什么原因，如何解決？SDS—PAGE的時候恒壓和恒流哪個好？
A8：非特異性的條帶和背景高：可能性很多，如一抗，二抗，封閉的原因都可能。總蛋白考染的時候發(fā)現(xiàn)接近積層膠的條帶比較清楚，條帶也很窄，可是越靠下面的條帶越來越寬，有的跑得都連在一起，這種現(xiàn)象是正常的。另外，也可能積層膠有問題。SDS—PAGE的時候，恒壓和恒流都可以用。
威尼德生物科技（北京）有限公司，研發(fā)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)型分子雜交儀VH-1000、多功能型分子雜交儀VH-4000、組合型分子雜交儀VH-2000，底部標(biāo)配培養(yǎng)皿圓周運(yùn)動托盤，選配250ML/500ML錐形瓶托盤， 96孔酶標(biāo)板托盤，可適用于如放置雜交袋等其他嚴(yán)格要求的孵育實(shí)驗(yàn)，，以及膜洗脫和凝膠脫色，同時可以做恒溫微生物培養(yǎng)。分子雜交儀是現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室采用雜交技術(shù)的理想設(shè)備，可替代塑料雜交袋和水浴搖床，并避免破損帶來的污染危害。
Q9: 血清樣品進(jìn)行Western blot 分析，目的蛋白21kD，結(jié)果顯色出來后，目的條帶很淡，而白蛋白和IgG條帶很濃，為什么？
A9：可能是因?yàn)榘椎鞍诪?7kD和目的蛋白相差較大，且其濃度較低，可以底物二氨基聯(lián)和0.01％溶液顯色的時間延長為30分鐘，再用去離子水漂洗以終止反應(yīng)；也可能是抗體的特異性不好。把封閉的時間延長，同時提高封閉液的濃度，可以減少以下背景噪音。同時洗的時候要干凈，而目的條帶弱，說明濃度不足，如果不考慮后續(xù)功能的話，可過G-50（細(xì)）柱子，純化靶蛋白，接著真空冷凍濃縮，可以得到很好的結(jié)果。
Q10: Western轉(zhuǎn)膜已經(jīng)成功了，但是Marker泳道未見蛋白條帶，其余各泳道均有清晰的蛋白條帶，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染膠，結(jié)果相同。經(jīng)5％的脫脂牛奶封閉1小時45分鐘后，進(jìn)行一抗孵育（1：200，建議起始濃度）過夜，二抗孵育5個半小時（1:2000），均在室溫下，DAB顯色，雖出現(xiàn)蛋白條帶，但較弱，且出現(xiàn)非特異性條帶。所用Marker可分離14-116KD的蛋白，是否因?yàn)閙arker有問題？一抗（多克隆抗體）、二抗的濃度及孵育的時間是否合適？封閉的時間是否太短？
A10：1. marker有可能被降解，也有可能是上樣量太少。
2. 建議一抗4℃孵育過夜，稀釋比為1:100；如室溫孵育，兩小時即可。
3. 二抗室溫1小時，1:2000，或 4℃封閉過夜（室溫兩小時就夠），一抗室溫1小時，二抗室溫1小時，建議是一抗4℃過夜（或室溫2小時）1:200，二抗室溫1小時1:2000，換ECL法。
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