威尼德生物科技（北京）有限公司
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閱讀：14發(fā)布時間：2026-5-23
1． 電穿孔前一至兩天，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至裝有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，保證實驗當(dāng)天細(xì)胞量達(dá)到70-90％。
2． 加培養(yǎng)基（不含抗生素）到24孔板中，每孔500µl，放于37℃培養(yǎng)箱預(yù)熱。（注：使用其他孔數(shù)培養(yǎng)板或者100µl槍頭時，加入培養(yǎng)基和質(zhì)粒及細(xì)胞的數(shù)量見下表1）威尼德生物科技（北京）有限公司（），研發(fā)生產(chǎn)的雙波型電穿孔儀Gene Pulser X2通過高強(qiáng)度的電場作用，瞬時提高細(xì)胞膜的通透性，從而吸收周圍介質(zhì)中的外源分子。這種技術(shù)將核苷酸、DNA與RNA、蛋白、糖類、染料以及病毒顆粒等導(dǎo)入原核和真核細(xì)胞內(nèi)。電轉(zhuǎn)化相對于其它物理和化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，是一種有價值和有效的替代方法。廣泛用于植物、動物和微生物的各類細(xì)胞電穿孔。
3． 將培養(yǎng)細(xì)胞取出，懸浮細(xì)胞直接取部分培養(yǎng)的細(xì)胞計數(shù)，確定細(xì)胞密度；貼壁細(xì)胞用2ml的PBS沖洗細(xì)胞，吸出PBS，加入約750µl消化3min，加入750µl培養(yǎng)基，終止消化，取部分細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，確定細(xì)胞密度。
4． 將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)到離心管，室溫下100-400g離心力離心5min，倒掉上清。
5． 向細(xì)胞中加入2mlPBS沖洗細(xì)胞，室溫下100-400g離心力離心5min。
6． 吸出PBS,用重懸緩沖液R重新懸浮細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞密度為2.0×107個/ml。輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液。（注：細(xì)胞懸液在室溫時間不能超過15-30min,否則將導(dǎo)致細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率降低）
7． 將適量質(zhì)粒加到1.5ml離心管中，再加入細(xì)胞懸液，輕輕混勻。所用細(xì)胞濃度、DNA和接種體積見下表1）。
8． 將裝有電解緩沖液裝入電轉(zhuǎn)杯中。
9． 在儀器上設(shè)置脈沖電壓、脈沖寬度、脈沖數(shù)。
10．用10µl的槍頭吸細(xì)胞混合液，槍頭中須無氣泡。
11．選擇電穿孔方案，并按下觸摸屏上的Start（開始）鍵。
12．電脈沖釋放后，觸摸屏上會顯示完成，提示電穿孔完成以及脈沖時間。
13．將脈沖好的樣品立即轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的裝有預(yù)熱培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板放到培養(yǎng)箱
培養(yǎng)。
14．實驗結(jié)束后，倒掉移液器中E液，關(guān)閉電轉(zhuǎn)儀。
15 正常培養(yǎng)4h，待細(xì)胞貼壁后，給細(xì)胞換新鮮的培養(yǎng)基，以去除上層的死細(xì)胞；
16 培養(yǎng)24h后，即可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的檢測或是進(jìn)行細(xì)胞實驗處理。
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