威尼德生物科技（北京）有限公司
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閱讀：17發(fā)布時間：2026-5-23
一、制備感受態(tài)的菌液收集時間：
1、準確測定OD值：OD在1.2～1.5之間。
1） 為了準確測定OD值，建議將菌液稀釋不同濃度測定（1、2、4、8、16倍稀釋，看其OD值是否呈線性關系）。每個倍數做3－5個重復，應該可以大致推斷OD值是否準確！菌液看上去渾濁，但OD值不高，很可能OD稀釋倍數不夠！
2） OD值是否測準也可以這樣估算：OD600為40左右時，菌體濕重（6000rpm離心5min）約0.95g/10ml。高密度發(fā)酵時菌體濕重將相應下降。
（MTT方法即比色法的吸收度在0.2～0.8之間誤差較小。這和分析化學中的ｌａｍｂｅｒｔ-beer定律有關， 對朗伯-比爾定律的偏離在吸光光度分析中，經常出現標準曲線不呈直線的情況，特別是當吸光物質濃度較高時，明顯地看到通過原點向濃度軸彎曲的現象（吸光度軸彎曲)。這種情況稱為偏離朗伯-比爾定律。若在曲線彎曲部分進行定量，將會引起較大的誤差。在吸光光度分析中，儀器測量不準確也是誤差的主要來源。任何光度計都有一定的測量誤差）
2、75ml的菌，經18h左右的培養(yǎng)，sorbital洗滌完畢后，50ml離心管里所剩菌體特別濃，需要1ml sorbitol才可溶解為糊狀。正常培養(yǎng)的OD在1.2～1.5之間的500ml菌液，收集的感受態(tài)也用1ml稀釋的，沒那么粘稠?？梢钥纯唇档团囵B(yǎng)溫度（27攝氏度）或縮短培養(yǎng)時間（12h）。
3、甚至不用轉接,直接挑單克隆在50－100mlYPD中搖過夜，效果也很好
二、制備感受態(tài)的菌液量
如果只轉一個樣品，50ml就夠了，一般50ml的培養(yǎng)液如果OD值正常的話夠做10管感受態(tài)的，其他的按比例縮小。用大試管搖5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受態(tài)，每一步的離心時間30秒就行。整個流程時間短，制備好的感受態(tài)用來做轉化的效率很高。
離心，洗滌的過程之后的重懸的時候注意濃度，不要過于粘稠和稀釋。
三、感受態(tài)的保存
感受態(tài)細胞做好后由于電轉化杯還沒有處理好等原因，在冰上放幾個小時再做可能有一定的影響，盡量馬上制備馬上轉化。如果感受態(tài)細胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP管分裝，-70 或 -80 攝氏度保存。
另附：酵母GS115分離純化
接種GS115于5ml YPD液體培養(yǎng)基，30℃，200rpm振蕩過夜，涂布 YPD平板，30℃培養(yǎng)48 小時，用 YNB基本培養(yǎng)基和含His的補充培養(yǎng)基作點種分離純化，挑選在補充培養(yǎng)基生上生長而在基本培養(yǎng)基上不生長的單菌落劃YPD平板，4℃保存。
四、電轉化注意點：
1、感受態(tài)做好后，一次吸出sorbital時，不是直接倒調的，而是用毛細管輕吸出來的，這樣可能使剩下的感受態(tài)純凈些。
2、用毛細管取出100ul出來，加入質粒，混勻?。ㄅ铝坎粔?，吸得很多，電轉時效果反而不好）
3、電轉杯清潔處理:一般先沖洗，洗凈；然后浸泡在75％的乙醇中；使用前我們都是放在超凈臺上，開啟紫外，邊吹風晾干，邊進行紫外照射。電轉杯的新包裝或重復使用可能對轉化率有一定的影響。
4、電擊的時候，電壓數以及電擊時間可以摸索一下，適當增加電壓或者延長電擊時間都可以。電擊條件比如1.5kv，放電4.8～5.5ms。電擊所有過程都要盡量在冰上進行，電擊時間可以減少一點，設置為5ms左右，電擊之后馬上加入預冷的溶液，轉移至EP管，30度靜止培養(yǎng)1h。如果菌體懸液濃度比較大的時候，在制備感受態(tài)的時候要留心一下操作中的問題了。
5、電擊之后，加入1ml的，吸入1.5ml的ep管中，置于30度搖床低速培養(yǎng)1h，再涂板。威尼德生物科技（北京）有限公司（），研發(fā)生產的雙波型電穿孔儀Gene Pulser X2通過高強度的電場作用，瞬時提高細胞膜的通透性，從而吸收周圍介質中的外源分子。這種技術將核苷酸、DNA與RNA、蛋白、糖類、染料以及病毒顆粒等導入原核和真核細胞內。電轉化相對于其它物理和化學轉化方法，是一種有價值和有效的替代方法。廣泛用于植物、動物和微生物的各類細胞電穿孔。
6、注意的是處理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT單獨于-20度保存，可配成100倍的貯備液。
7、轉化后1ml用sorbitol重懸的細胞懸液不能全部涂在一塊板子上，按標準程序制作的感受態(tài)一般3塊左右可能比較合適，以干燥后看見一薄層淡淡的白色為宜。轉化子會在白色的薄層上長出圓韻、飽滿的大菌落的。
五、轉化試劑和培養(yǎng)基的正確準備方法
1、MD板子提前幾天做好，放在冰箱里，涂板的時候吸收效果會好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些積層，反而不利于生長。
2、YNB 42度水浴一會，然后過濾除菌，YNB是加到培養(yǎng)基里面的，去離子水pH偏低，建議直接用蒸餾水就可以（關系不是太大）。
3、，以及無菌去離子水均是冰凍，存放在4度冰箱中
4、一般用10ug以上質粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，約20ul ddH2O重溶。轉化效率一般大于100個克隆每ugDNA。有人用LiCl和DTT處理細胞，轉化效率很高，可以試試。建議你不要用膠回收kit，回收的DNA可能還有鹽，導致電擊時放電時間很短。
5個電轉化方案
方法一：
1.收集菌體
取1mlGS115過夜培養(yǎng)物(OD約6-10) 分裝到1.5ml EP管中，4℃、10000g 離心1min，棄上清，沉淀用無菌水(4℃)洗滌，同樣條件下離心，棄上清。
2.菌體處理
加入1ml處理液，室溫下放置20min。
處理液：
10mM LiAc
10mM DTT（二硫蘇糖醇，常用還原劑，有抗氧化作用）
0.6M sorbitol
10mM TrisHCl(pH7.5)
3.離心，棄上清，加入1ml 1M sorbitol ，離心，棄上清，
4.用1M sorbitol洗滌二次，到體積約為80μl.（菌體太多可適當棄去部分）
5.加入10μl.經過BglⅡ酶切處理的工程質粒，混勻后轉入 電擊杯中，冰浴5min.
6.電轉. 1.5kv，25μF，200Ω條件下進行電轉。
7.電擊后立刻加入1mL 1M sorbitol，吸出后于30℃培養(yǎng)2h。
8.取一定量涂平板(YPDS + Zeocin，涂布的量分別為100、200微升，剩余的經離心處理后全部涂在一個平板上)
有一點要注意的是處理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT單獨于-20度保存，可配成100倍的貯備液。
方法二：按下面步驟轉化,開始每個板子只長了一二十菌落;小細節(jié)修改后,每個板長了約100個.
步驟如下：
1、目的DNA（pPIC9K)，經電泳檢測已經線性化（SalI酶切）；
2、DNA純化方法是經酚仿－氯仿兩步抽提后，無水乙醇沉淀的，目測定量應足夠；
3、GS115甘油菌經新鮮平板復蘇后，5ML培養(yǎng)過夜，16h左右后，取菌1：100稀釋，接種于70ml菌液擴大培養(yǎng)，14h后測得OD600約1.3左右。
4、將sorbital、水和菌液均冰??；
5、菌液離心5min－100ml冰水洗滌－50ml冰水洗滌－4ml sorbital洗滌，然后溶解于300ul冰sorbital；
6、加入約5～10ug的DNA，槍吹勻，置0.2CM電轉杯靜置5min；
7、電擊，1,5KV.
8、立即加入1ml冰浴的sorbital，靜止10min。威尼德生物科技（北京）有限公司（），研發(fā)生產的雙波型電穿孔儀Gene Pulser X2通過高強度的電場作用，瞬時提高細胞膜的通透性，從而吸收周圍介質中的外源分子。這種技術將核苷酸、DNA與RNA、蛋白、糖類、染料以及病毒顆粒等導入原核和真核細胞內。電轉化相對于其它物理和化學轉化方法，是一種有價值和有效的替代方法。廣泛用于植物、動物和微生物的各類細胞電穿孔。
9、取100ul轉化液，涂布10cm的MD平板。
做了一點修改每塊板子大概能長100來個菌落（一般需要2天左右）：
1、菌液收集時間：以前可能是OD值測得不太準確，我然后把菌液分別做了1、2、4、8、16倍稀釋，看其OD值是否呈線性關系。1、菌液測OD值時，建議將菌液稀釋不同濃度測定，這樣才準確些。菌液看上去渾濁，但OD值不高，很可能就是你的OD稀釋倍數不夠！你分別稀釋2倍、4倍、8倍、10倍等，每個倍數做3－5個重復，應該可以大致推斷OD值是否準確！
2、我開始是先挑單克隆于5mlYPD中，過夜16h后，轉接于50ml YPD中，培養(yǎng)大概18個小時吧。OD值是否測準可以這樣估算：OD600為40左右時，菌體濕重（6000rpm離心5min）約0.95g/10ml。高密度發(fā)酵時菌體濕重將相應下降。
3、電擊條件等上面帖子上都有，1.5kv，放電4.8～5.5ms。
2、其它做法相同，就是感受態(tài)做好后，一次吸出sorbital時，不是直接倒調的，而是用毛細管輕吸出來的，這樣可能使剩下的感受態(tài)純凈些。
3、用毛細管取出100ul出來，加入質粒，混勻?。ㄎ乙郧芭铝坎粔?，吸得很多，電轉時效果反而不好。 ）
4、MD板子提前幾天做好，放在冰箱里，涂板的時候吸收效果會好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些積層，反而不利于生長。
5、你說的YNB，我用的是成品，只需要直接配制。42度水浴一會，然后過濾除菌。我沒有加硫酸銨。YNB是加到培養(yǎng)基里面的，去離子水pH偏低哦，我建議直接用蒸餾水就可以了（關系不是太大）。
方法三：簡便獨特
在篩選高表達菌種中，與大多數人和說明書有區(qū)別(成功做出幾個基因):
每次轉化前，均用多種酶BlgII/salI/sacI同時切，轉化時，用GS115/KM71/KM71H同時轉化，轉化的條件也和大家一樣，即1.5/25/200,但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，轉化后涂MM及YPD+0.25G，長出菌落后，即進行大規(guī)模的表達試驗，直接用YPD表達的，一般48h后即進行大量的SDS-PAGE鑒定，鑒定時，樣品不用濃縮，直接上樣，看到目的帶后再做PCR，測序。
方法四：沒有轉化子（無aa的YNB和硫酸銨稱好后，去離子水溶解，然后高壓滅菌）
1.挑取酵母單菌落，接種至含有50ml YPD培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、250-300rpm培養(yǎng)過夜約14h，OD600約1.3
2.菌液離心5min－50ml冰水洗滌－25ml冰水洗滌－2ml sorbital洗滌，然后溶解于200ul冰sorbital；兩管分裝，每管100ul
3.加入約5～10ug的線性化的DNA20ul，槍吹勻，置0.2CM電轉杯冰浴5min；
4.電擊，1,5KV.使用的是 Eppendorf 2510，用于轉化細菌及酵母。
5.立即加入1ml冰浴的sorbital，靜止1h。
將菌體懸液涂布于MD平板上，每300µl涂布一塊平板；
方法五: 和Invitrogen公司說明書差不多的方法
X33菌株于100ml YPD搖到OD600約1.1-1.3，太高影響感受態(tài)效率
(1) 1500－1700g離心5min，將離心管倒置在吸水紙上輕輕控幾下，充分棄上清
(2) 加入100ml 冰浴的超純水ddH2O，可在振蕩器上振蕩混勻，可靜置3－5分鐘
(3) 離心，棄上清，再加100ml ddH2O洗一遍
(4) 離心，棄上清，加20ml 冰浴1M Sorbitol洗一遍
(5) 離心，棄上清，菌體置于冰浴中，加入約100－200ul Sorbitol混勻
加入Sorbitol量需自己調整，這時菌液很濃，只要能夠用200ul黃槍頭吸出來就可以了，一般共有約400－500ul，夠做幾管感受態(tài)了。
(7) 吸取100－150ul感受態(tài)到線性化的DNA中，用槍頭打勻或手指彈勻
靜置5min，于2mm電轉化杯中，電擊參數：1.5KV，25uF，200歐姆（不是400），一般放電時間在4.5-4.9ms之間，小于4說明你的DNA鹽濃度太高
(9) 立即加入1ml Sorbitol，轉入10ml 離心管，30度靜置1小時，然后加入1ml YPD，30度，200rpm搖1小時，取50－200ul菌液涂100ul/ml YPDS板
(10) 一般轉化效率可以達到：200個以上轉化子每200ul菌液，足夠篩選表達菌株了。
方法六:酵母感受態(tài)細胞的制備威尼德生物科技（北京）有限公司（），研發(fā)生產的雙波型電穿孔儀Gene Pulser X2通過高強度的電場作用，瞬時提高細胞膜的通透性，從而吸收周圍介質中的外源分子。這種技術將核苷酸、DNA與RNA、蛋白、糖類、染料以及病毒顆粒等導入原核和真核細胞內。電轉化相對于其它物理和化學轉化方法，是一種有價值和有效的替代方法。廣泛用于植物、動物和微生物的各類細胞電穿孔。
⑴ 接種Pichia pastoris GS115于5 ml YPD液體培養(yǎng)基，30℃，250~300250 rpm ，過夜。
⑵ 取200µl的培養(yǎng)物接種至含有500ml新鮮培養(yǎng)基的三角搖瓶中，28~30℃、250~300r/min培養(yǎng)過夜，一般12小時左右。
⑶ 將細胞培養(yǎng)物于4℃，5000g離心5min，用500ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；
⑷ 按步驟3離心，用250ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；
⑸ 按步驟3離心，用20ml的冰預冷的1M的溶液將菌體沉淀重懸；
⑹ 按步驟3離心，用1ml的冰預冷的1M的溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為2ml；
⑺ NOTE：可將其分裝為200µl一份的包裝冷凍起來，但如果保存時間過長會影響其轉化效率。
化學轉化
畢氏酵母氯化鋰轉化法
試劑
1. 1M LiCl：用去離子蒸餾水配制，濾膜過濾除菌；必要時用消毒去離子水稀釋
2. 50百分子 PEG3350 ：Sigma P3640 用去離子蒸餾水配制，濾膜過濾除菌，用較緊的蓋子的瓶子分裝
3. 2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存
注：醋酸鋰對畢氏酵母無效，僅氯化鋰有效；PEG3350可屏蔽高濃度LiCl的毒害作用；
畢氏酵母的轉化
1. 煮沸1ml鮭魚精DNA 5min，迅速冰浴以制備單鏈擔體DNA；
2. 將感受態(tài)酵母菌離心，以Tips去除殘余的LiCl溶液；
3. 對于每一個轉化，按以下順序加入：
50％PEG3350 240ul
1M LiCl 36ul
2mg/ml 單鏈Salmon sperm DNA 25ul
5～10ug/50ul H2O 質粒DNA 50ul
4. 劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體分布均勻（約1min）；
5. 30℃水浴孵育30min；
6. 42℃水浴熱休克20～25min;
7. 6000～8000rpm離心收集酵母菌體；
8. 重懸酵母于1ml YPD培養(yǎng)基，30℃搖床孵育；
9. 1～4h后，取25～100ul菌液鋪選擇性培養(yǎng)基平板，于30℃培養(yǎng)2～3天鑒定（將表達菌株和對照菌株在固體培養(yǎng)基平板，30'c培養(yǎng)至轉化子出現）
畢氏酵母PEG1000轉化法
試劑
緩沖液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3％（v/v）ethylene glycol
緩沖液B：40％（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35
緩沖液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35
未污染的新鮮、試劑級DMSO，-70℃保存
注：1. 緩沖液A、B、C均用濾膜過濾，-20℃保存;
2. 將DNA直接加在凍結的酵母細胞上是本實驗的關鍵之處（即使在冰上解凍的待轉化細胞，其攝取外源DNA的能力也在解凍過程中迅速下降；如進行多樣品的轉化，建議按6樣品/組進行）;
待轉化畢氏酵母的制備
1. 接種環(huán)接種Pachia pastoris于YPD平板，30℃培養(yǎng)2d;
2. 挑取單克隆酵母菌株于10mlYPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)過夜；
3. 取步驟2中小量菌液接種到100mlYPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待其OD值從0.1升到0.5～0.8；
4. 室溫下3000g離心收集酵母菌體，50ml緩沖液A洗滌一次；
5. 重懸菌體于4ml緩沖液A中，按0.2ml/管分裝于1.5ml的離心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷凍，
6. -70℃保存
畢氏酵母的轉化
1. 將約50ug線性化質粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于凍結的酵母細胞中；加入擔體DNA（40ug變性超聲線性化鮭魚精DNA）以獲得大轉化率；
2. 37℃水浴孵育5min，中間混合樣品1～2次；
3. 取出離心管，加入1.5ml緩沖液B，混勻；
4. 30℃水浴孵育1h；
5. 室溫下2000g離心10min，去除上清液，菌體沉淀重懸于1.5ml緩沖液C中；
6. 離心樣品，去除上清液，輕微操作將樣品重懸于0.2ml緩沖液C中；
7. 將所有轉化液鋪于選擇性平板，于30℃孵育3～4天后，鑒定；威尼德生物科技（北京）有限公司（），研發(fā)生產的雙波型電穿孔儀Gene Pulser X2通過高強度的電場作用，瞬時提高細胞膜的通透性，從而吸收周圍介質中的外源分子。這種技術將核苷酸、DNA與RNA、蛋白、糖類、染料以及病毒顆粒等導入原核和真核細胞內。電轉化相對于其它物理和化學轉化方法，是一種有價值和有效的替代方法。廣泛用于植物、動物和微生物的各類細胞電穿孔。
畢赤酵母轉化方法有4 種 。常用的是電轉化法和原生質體法,其中電轉化法方便,轉化效率高,容易產生多拷貝整合。由于原生質體法須首先制備去除細胞壁的原生質體細胞以利于DNA 進入,然后細胞再生細胞壁,產生轉化體,而ZeocinR 控制細胞壁的形成,導致不能產生轉化體。因此利用ZeocinR 作為選擇標記的載體如p PICZ 系列,不能使用原生質體法進行轉化。
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