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閱讀：27發(fā)布時(shí)間：2026-5-23
紫外交聯(lián)儀">紫外交聯(lián)儀 1 問題：做轉(zhuǎn)化時(shí)，用藍(lán)白斑篩選，以獲得陽性克隆。那它和直接利用AMP抗性，而不用藍(lán)白斑篩選，有什么區(qū)別嗎？藍(lán)白斑篩選有什么作用嗎？
對(duì)于這一問題，我想，抗性篩選是防止雜菌生長。理論上說，當(dāng)培養(yǎng)基中含有抗生素時(shí)，只有攜帶相應(yīng)抗藥性基因載體的細(xì)胞才能生存繁殖。藍(lán)白篩選是驗(yàn)證是否有插入片斷。兩者結(jié)合起來，更有利于篩選到我們的目的菌。
威尼德生物科技（北京）有限公司（），研發(fā)生產(chǎn)的雙波型電穿孔儀Gene Pulser X2通過高強(qiáng)度的電場(chǎng)作用，瞬時(shí)提高細(xì)胞膜的通透性，從而吸收周圍介質(zhì)中的外源分子。這種技術(shù)將核苷酸、DNA與RNA、蛋白、糖類、染料以及病毒顆粒等導(dǎo)入原核和真核細(xì)胞內(nèi)。電轉(zhuǎn)化相對(duì)于其它物理和化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，是一種有價(jià)值和有效的替代方法。廣泛用于植物、動(dòng)物和微生物的各類細(xì)胞電穿孔。
2 問題：如果加了AMP、IPTG和X-Gal，長出來的白斑一定都是含有插入片段的嗎？有沒有可能是載體自連的？
答：可以說，世界上沒有的事情，即使加了AMP、IPTG和X-Gal，長出來的白斑也不一定都是含有插入片段的陽性克隆，具體原因可能有：
1）有可能是載體自連的假陽性；
2）作時(shí)AMP、IPTG和X-Gal其中一種或幾種沒涂均勻。
3）有時(shí)即使插入片段也會(huì)出現(xiàn)籃斑。只要編碼框沒被破壞。
3 問題：如何篩選重組菌落?
答：可使用藍(lán)/白斑篩選法，在涂布有IPTG和X-Gal的篩選平板上，重組菌株為白色，未轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的菌株為藍(lán)色。
4 問題：藍(lán)白斑篩選如何篩選合適的宿主菌株?
答：如進(jìn)行藍(lán)/白斑篩選，宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽編碼區(qū)應(yīng)在染色體或附加體上缺失掉（lacZΔΜ15）。0和DH5α都能用于藍(lán)/白斑篩選。
5 問題：在藍(lán)白斑篩選的過程中沒有藍(lán)斑是什么原因?qū)е碌?？因?yàn)橥ㄟ^PCR檢測(cè)插入片段的大小表明所挑的白斑克隆并沒有插入片段。
答：原因很多，1）可能是你用的培養(yǎng)基含有乳糖或葡萄糖，因?yàn)榘肴樘歉拭笗?huì)分解乳糖，導(dǎo)致不能與X-Gal反應(yīng)，葡萄糖不會(huì)誘導(dǎo)融合基因的表達(dá)。2）作時(shí)AMP、IPTG和X-Gal其中一種或幾種沒涂均勻。3）很多因素會(huì)造成PCR失敗。
6 問題：我近期轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)，通過藍(lán)白斑篩選，挑出白色菌落做PCR，可是在電泳時(shí)發(fā)現(xiàn)在有目的帶的同時(shí)還有比目的帶小的雜帶，不知為什么？我反復(fù)篩了幾次，都是這樣，可不可以搖菌提質(zhì)粒？我應(yīng)該下一步怎么做？
答：針對(duì)這樣的情況，我覺得，你首先做酶切鑒定，看看你的目的片段是否真 正插入。其次，你應(yīng)該檢測(cè)PCR過程有沒有問題。
7 問題：我用Amp-IPTG-X-gal LB平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選重組子，為何篩出的全是白斑，沒一個(gè)藍(lán)斑，挑幾個(gè)白斑搖菌擴(kuò)增后PCR檢測(cè)也全是陽性克隆，不會(huì)全都重組成功了吧？什么原因呢？
答：這樣的情況是有可能的，只要載體處理的好，應(yīng)該說是有這種可能。
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