高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography  HPLC）又稱“高壓液相色譜"、“高速液相色譜"、“高分離度液相色譜"、“近代柱色譜"等。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)應(yīng)用  。

高效液相色譜特點(diǎn)

高效液相色譜法有“四高一廣"的特點(diǎn)：

①高壓：流動(dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過(guò)色譜柱，必須對(duì)載液加高壓。

②高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)。

③高效：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。

④高靈敏度：紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在μL數(shù)量級(jí)。

⑤應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢(shì)。

⑥柱子可反復(fù)使用：用一根柱子可分離不同化合物

⑦樣品量少、容易回收：樣品經(jīng)過(guò)色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

此外高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)，與氣相色譜相比各有所長(zhǎng)，相互補(bǔ)充。高效液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)"。在從進(jìn)樣到檢測(cè)器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測(cè)池等）中，如果流動(dòng)相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會(huì)顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測(cè)器的靈敏度不及氣相色譜。

故障排除方法

1.從壓力變化判斷：壓力高；壓力低；壓力波動(dòng)；
2.泵頭漏液

判斷:

（1）接口太松（2）泵密封墊磨損；

故障排除:

（1）擰緊泵頭螺絲（2）更換密封墊；

3.泵不送溶劑；

判斷：

（1）泵頭有氣泡

（2）使用的溶劑黏性抬高

（3）溶劑貯液器中過(guò)濾器臟

（4）排空閥打開(kāi)

（5）控制器設(shè)定不正確

（6）流動(dòng)相不夠；

故障排除：

（1）排氣泡，溶劑需脫氣；

（2）換低黏性溶劑；
（3）清洗貯液瓶、過(guò)濾器；

（4）排空閥打開(kāi)：關(guān)閉排空閥；

（5）控制器設(shè)置不正確：設(shè)置正確；

（6）流動(dòng)相不夠：補(bǔ)足流動(dòng)相

4.峰前沿

判斷；

（1）柱性能下降

（2）保護(hù)柱失效.

（3）進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高

故障排除：

（1）更換色譜柱

（2）換柱芯

（3）降低進(jìn)樣體積或降低樣品濃度

 5.峰拖尾

判斷：

（1）柱性能下降

（2）保護(hù)柱失效，

（3）色譜柱或保護(hù)柱被污染

（4）色譜柱選擇不當(dāng)

（5）流動(dòng)相選擇不當(dāng)

故障排除：

（1）更換色譜柱

（2）換柱芯

（3）清洗柱或保護(hù)柱，必要時(shí)更換

（4）選擇恰當(dāng)?shù)纳V柱

（5）選擇恰當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相

 6.峰變寬

判斷：

（1）柱性能下降

（2）保護(hù)柱失效.

（3）色譜柱或保護(hù)柱被污染

（4）色譜柱選擇不當(dāng)

（5）流動(dòng)相選擇不當(dāng)

（6）流動(dòng)相流速太低

（7）緩沖液濃度太低

（8）系統(tǒng)沒(méi)到達(dá)平衡

（9）進(jìn)樣器問(wèn)題

（10）環(huán)境溫度變化

（11）漏夜

（12）出現(xiàn)兩個(gè)或多個(gè)未被

（13）分離的物質(zhì)的峰

（14）檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)太大

故障排除：

（1）更換色措柱

（2）換柱芯

（3）清洗柱或保護(hù)柱，必要時(shí)更換

（4）選擇恰當(dāng)?shù)纳V柱

（5）選擇恰當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相

（6）調(diào)節(jié)流速

（7）增加濃度

（8）使系統(tǒng)到達(dá)平衡

（9）檢查進(jìn)樣器

（10）使用柱溫箱

（11）檢查漏夜的位置并維修

（12）選擇其它色譜條件以改善分

（13）離效果

（14）使用較小的時(shí)間常數(shù)

 7.峰分叉

判斷:

（1）柱性能下降

（2）保護(hù)柱失效

（3）色譜柱或保護(hù)柱被污染

（4）進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高

（5）樣品溶劑不溶流動(dòng)相

故障排除：

（1）更換色普柱

（2）換柱芯

（3）清洗柱或保護(hù)柱，必要時(shí)更換

（4）降低進(jìn)樣體積或降低樣品濃度

（5）改變?nèi)軇┗虿捎昧鲃?dòng)相溶解樣品

 8.無(wú)峰

判斷：

（1）檢測(cè)器參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤

（2）樣品降解

（3）自動(dòng)進(jìn)樣器故障

（4）無(wú)樣品

（5）檢測(cè)器與數(shù)據(jù)處理裝置鏈接故障

故障排除：

（1）設(shè)置正確的檢測(cè)器參數(shù)

（2）檢查樣品配制過(guò)程，更換樣

（3）檢查進(jìn)樣器

（4）加樣品

（5）檢查并正確鏈接

 9.鬼峰

判斷：

（1）樣品前處理時(shí)產(chǎn)生降解或混入雜質(zhì)

（2）前一次進(jìn)樣的洗脫物

（3）注射器臟

（4）流動(dòng)相被污染

（5）柱被污染

（6）六通閥污染

（7）檢測(cè)器污染

（8）管路污染

（9）流動(dòng)相中含有穩(wěn)定劑或穩(wěn)定劑變化

故障排除：

（1）用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照、檢查樣品處理過(guò)程，換新樣品

（2）增加分析時(shí)間或梯度洗脫、提高流速、如問(wèn)題仍存在，兩次進(jìn)樣間用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱

（3）清洗注射器、神洗進(jìn)樣口

（4）清洗溶劑貯液瓶、清洗溶劑

（5）入口過(guò)濾器、使用HPLC級(jí)

（6）試劑

（7）清洗柱或更換柱

（8）清洗六通閥

（9）清晰檢測(cè)器

（10）沖洗

（11）使用無(wú)防腐溶劑

 10.負(fù)峰

出現(xiàn)所有負(fù)峰；

判斷：

（1）連接數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)信號(hào)線接反

（2）記錄儀或檢測(cè)器信號(hào)極性相反

故障排除：

（1）正確連接

（2）改變極性設(shè)置

 11.出現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)負(fù)峰

判斷：

（1）離子對(duì)分離體系對(duì)峰的影響

（2）使用的流動(dòng)相吸收高

（3）自動(dòng)進(jìn)樣器注射進(jìn)空氣

故障排除：

（1）在流動(dòng)相中溶解樣品

（2）使用流動(dòng)相稀釋樣品

（3）清洗自動(dòng)進(jìn)樣器

 12.保留時(shí)間變化

判斷：

（1）系統(tǒng)不問(wèn)或未達(dá)到平衡

（2）室溫波動(dòng)大

（3）柱被污染

（4）溶劑配比不合適

（5）進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高

故障排除：

（1）分析之前應(yīng)有足夠的時(shí)間使系統(tǒng)平衡

（2）使用柱溫箱、將系統(tǒng)置于恒溫、空氣對(duì)流小的環(huán)境

（3）沖洗柱或更換柱

（4）調(diào)節(jié)溶劑配比

（5）減小進(jìn)樣體積

 13.保留時(shí)間不斷變化：

判斷;

（1）流速變化

（2）系統(tǒng)沒(méi)有達(dá)到平衡

（3）柱被污染

（4）流動(dòng)相被污染

（5）系統(tǒng)泄漏

（6）流動(dòng)相脫氣不夠充分

（7）室溫變化

（8）柱恒溫箱設(shè)置有誤

故障排除：

（1）重新設(shè)定流速,檢查泵是否正常工作

（2）分析之前應(yīng)有足夠的時(shí)間使系統(tǒng)平衡

（3）沖洗柱或更換柱

（4）清洗溶劑貯液瓶、清洗溶劑入口過(guò)濾器、使用HPLC級(jí)試劑

（5）檢查并進(jìn)行維修

（6）清洗溶劑貯液瓶、清洗溶劑入口過(guò)濾器、使用HPLC級(jí)試劑

（7）使用柱溫箱、將系統(tǒng)置于恒溫、空氣對(duì)流小的環(huán)境

（8）設(shè)置正確的溫度

 14.基線漂移

判斷：

（1）系統(tǒng)不穩(wěn)或沒(méi)有達(dá)到平衡

（2）室溫不穩(wěn)

（3）流動(dòng)相污染或分解

（4）流動(dòng)相脫氣不充分

（5）流動(dòng)相配比不當(dāng)或流速變化

（6）柱被污染

（7）固定相流失

（8）檢測(cè)池被污染或有氣體

（9）測(cè)定的波長(zhǎng)選擇有誤

（10）系統(tǒng)泄漏

（11）樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)

故障排除：

（1）分析之前應(yīng)有足夠的時(shí)間使系統(tǒng)平衡

（2）使用柱溫箱、將系統(tǒng)置于恒溫、空氣對(duì)流小的環(huán)境

（3）清洗溶劑貯液瓶、清洗溶劑試劑

（4）脫氣重新平衡系統(tǒng)

（5）更改配比或流速

（6）沖洗柱或更換柱

（7）為說(shuō)明問(wèn)題存在，用一-段連接管路代替色譜柱，通流動(dòng)相檢測(cè)基線

（8）用甲醇或其他強(qiáng)極性的溶劑沖洗流通池

（9）使用分光光度計(jì)說(shuō)明背景吸收，如背景值高，說(shuō)明流動(dòng)相含有紫外吸收化合物導(dǎo)致基線漂移。使用的流動(dòng)相應(yīng)在紫外截止波長(zhǎng)以外，或更換溶劑

（10）檢查并進(jìn)行維修

（11）用強(qiáng)度合適的溶劑清洗色譜柱

 15.無(wú)規(guī)則基線噪音

判斷：

（1）系統(tǒng)不穩(wěn)或沒(méi)有達(dá)到平衡

（2）系統(tǒng)泄漏

（3）流動(dòng)相污染或分解

（4）柱被污染

（5）色譜柱填料流失或阻塞

（6）流動(dòng)相混合不均或混合器工作不正常

（7）檢測(cè)池被污染

（8）系統(tǒng)內(nèi)有氣泡

（9）檢測(cè)器內(nèi)有氣泡

（10）檢測(cè)器燈能量不足

故障排除：

（1）分析之前應(yīng)有足夠的時(shí)間使系統(tǒng)平衡

（2）檢查并進(jìn)行維修

（3）清洗溶劑貯液瓶、清洗溶劑入口過(guò)濾器、使用HPLC級(jí)試劑

（4）沖洗柱或更換柱

（5）更換色譜柱

（6）維修或更換混合器

（7）用甲醇或其他強(qiáng)極性的溶劑神洗流通池

（8）用強(qiáng)極性的溶劑清洗系統(tǒng)

（9）清洗檢測(cè)器，在檢測(cè)器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器

（10）更換燈

 16.規(guī)則基線噪音；

判斷：

（1）流動(dòng)相、檢測(cè)器或泵內(nèi)有氣泡

（2）室溫不穩(wěn)

（3）流動(dòng)相回收使用

（4）流動(dòng)相混合不

（5）泵振動(dòng)

（6）泵入口管路松或阻塞

（7）在同一水平上有其他設(shè)備

故障排除：

（1）流動(dòng)相脫氣，沖洗系統(tǒng)除去檢測(cè)器或泵內(nèi)的空氣

（2）穩(wěn)定環(huán)境溫度。使用柱溫箱、將系統(tǒng)置于恒溫、空氣對(duì)流小的環(huán)境

（3）除非特殊需要不使用回收溶劑

（4）使流動(dòng)相混合均勻或使用低黏度的溶劑

（5）在系統(tǒng)中假如脈沖阻尼器

（6）檢查泵入口管路

（7）關(guān)掉儀器，檢查干擾是否來(lái)自于外部