液相色譜柱的結(jié)構(gòu)：

（1）液相色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲（封頭）與柱填料等組成。

柱管：多用不銹鋼制成，若果使用時(shí)柱壓不高于70kg/cm2時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。用于柱填料的裝填?？罩鹘M件均為不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長(zhǎng)時(shí)間存留此類(lèi)溶劑，以避免腐蝕。壓帽：即色譜柱兩端套合于柱管端外壁的塑性圓柱帽，中部有小孔，多為聚四氟乙烯制成，用于固定篩板。

密封環(huán)：位于接頭螺旋環(huán)內(nèi)壁的彈性環(huán)，多為聚四氟乙烯制成，用于色譜柱兩端壓帽與柱外壁的密封。

（2）柱填料：

液相色譜柱的分離作用是在填料與流動(dòng)相之間進(jìn)行的，柱子的分類(lèi)是依據(jù)填料類(lèi)型而定。

正相柱：

多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無(wú)定型和球型兩種，其顆粒直徑在3-10 μm的范圍內(nèi)。另一類(lèi)正相填料是硅膠表面鍵合-CN，-NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。

反相柱：

主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的非極性填料。也有無(wú)定型和球型之分。

常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3-10μm之間。

色譜柱的安裝：

（1）拆開(kāi)柱包裝盒，確認(rèn)色譜柱的類(lèi)型、尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。

（2）擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。

（3）按柱管上標(biāo)示的流動(dòng)相流向，將色譜柱的入口端通過(guò)連接管與進(jìn)樣閥出口相連接(如，條件允許，建議在柱前使用保護(hù)柱)；柱的出口與檢測(cè)器連接。連接管是外徑為1.57 mm、內(nèi)徑為0.1～0.3 mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時(shí)一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接管通過(guò)空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時(shí)針擰緊空心螺釘，直到擰不動(dòng)為止。

色譜柱的維護(hù):

1、良好的儲(chǔ)存條件：在未使用時(shí)，應(yīng)將液相色譜柱儲(chǔ)存在干燥、陰涼、避光和無(wú)塵的環(huán)境中。如需長(zhǎng)期存儲(chǔ)，應(yīng)使用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑或溶劑保存。

2、洗脫緩慢：在液相色譜分析過(guò)程中，需要注意洗脫緩慢，以避免對(duì)柱產(chǎn)生沖擊。不要突然改變洗脫速度，這可能會(huì)導(dǎo)致柱內(nèi)堵塞或損壞。

3、定期清洗：定期清洗柱子，可以去除殘留溶劑和雜質(zhì)，延長(zhǎng)柱壽命。一般建議每隔100-200個(gè)樣品進(jìn)行一次清洗，清洗液通常為純水、乙醇或甲醇等。

4、避免高溫：避免將液相色譜柱暴露在高溫環(huán)境中，因?yàn)楦邷貢?huì)影響柱子的穩(wěn)定性和分離效果。在分析結(jié)束后，應(yīng)立即將柱子移出儀器并存放在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中。

5、轉(zhuǎn)換流體：在使用不同相時(shí)，應(yīng)謹(jǐn)慎轉(zhuǎn)換流體。必要時(shí)，在更換相的過(guò)程中，可以使用簡(jiǎn)單的“溫和"方法，例如交替使用乙醇和水進(jìn)行流動(dòng)，以使柱內(nèi)緩慢地恢復(fù)平衡。

液相色譜柱的使用:

色譜柱在使用前，進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來(lái)，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是條件)，只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。

1.樣品的前處理：

（1）使用流動(dòng)相溶解樣品；

（2）使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)；

（3）使用0.45μm的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)；

2.流動(dòng)相的配制：

液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此，要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：

（1）流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)。

（2）流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。

（3）流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)，降低柱壓降，延長(zhǎng)液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。

（4）流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)，如使用UV檢測(cè)器，使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。

（5）流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。

（6）在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

3. 流速的選擇：

因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求柱效，使用流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1mL/min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8mL/min為佳。當(dāng)選用流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如，使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。

4. 流動(dòng)相使用注意事項(xiàng)：

（1）由于甲醇廉價(jià)，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場(chǎng)合除外)。

（2）對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60 ℃的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒(méi)有提純的己烷不得使用。用水使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類(lèi)雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。

（3）含水流動(dòng)相在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。加入，防止細(xì)菌生長(zhǎng)。

（4）流動(dòng)相要求使用0.45μm濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì)。

（5）使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能。

常見(jiàn)的問(wèn)題及解決方法:

1.使用一段時(shí)間后柱壓過(guò)高：

解決方法：首先查看是否HPLC系統(tǒng)原因，排除系統(tǒng)原因后，原因基本是由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中雜質(zhì)在柱中的累積。盡量*操作條件，做完樣品后要及時(shí)沖洗干凈，如緩沖鹽的流動(dòng)相一定要用高比例的水溶液(如，90％)沖洗后再用有機(jī)相保存。

2.篩板堵塞與柱頭塌陷：

解決方法：如確定是色譜柱頭的過(guò)濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，小心取下篩板，用5%左右的硝酸溶液超聲處理20分鐘左右，再用純水超聲20分鐘左右，重新裝入色譜柱。

3.色譜柱頭的填料被樣品污染：

解決方法：如確定色譜柱頭的填料被污染，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內(nèi)前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔細(xì)修復(fù)后，重新安裝上柱頭螺絲。

4.色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機(jī)溶劑，形成結(jié)晶析出：

解決方法：如確定是鹽結(jié)晶，用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內(nèi)鹽全部溶解，再換高濃度甲醇。