液相色譜儀的結(jié)構(gòu)及原理

一.結(jié)構(gòu)

高效液相色譜儀主要由儲液器、高壓泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀六部分組成。
1、儲液器

儲液器是用于存放溶劑的裝置。貯液器中的溶劑必須很純，貯液器材料要耐腐蝕，對溶劑呈惰性，一般情況下通常采用1升~2升的大容量玻璃瓶，也可采用不銹鋼制成的容器，貯液器應配有溶劑過濾器，以防止流動相中的顆粒進入泵內(nèi)，溶劑過濾器一般用耐腐蝕的鎳合金制成，孔隙大小一般為2μm。

2、高壓泵

高壓泵應耐壓、耐腐蝕、密封性好。其主要用于輸送流動相，其壓力一般為幾兆帕至數(shù)十兆帕，這時液體的黏度比氣體大 100 倍。同時由于固定相的顆粒極細，柱內(nèi)壓降大，為保證一定的流速，必須借助高壓迫使流動相通過柱子。高壓泵應無脈動或脈動極小，以保證輸出的流動相具有恒定的流速，同時采用脈動阻尼裝置可將產(chǎn)生的脈動除去，使流動相的流量變動范圍不宜超過 2%~3%。高壓泵主要分為恒壓泵、恒流泵和螺旋傳動注射泵三類。

（1）恒壓泵

恒壓泵輸出的壓力恒定，當具有一定壓力的氣體作用在一個大面積活塞上,大面積活塞再驅(qū)動一個小面積活塞，小面積活塞承受的壓力是大面積活塞的幾十倍，從而得到壓力恒定的流出液。

（2）恒流泵

恒流泵的主要功能是輸出的流量恒定，如往復柱塞泵、螺旋傳動注射泵等。往復柱塞泵與恒壓泵不同，通常采用電驅(qū)動活塞，當活塞迅速向上動時，由于減壓使入口止逆閥開啟，出口止逆閥關(guān)閉，貯液器中的流動相被吸入柱內(nèi)，形成一個循環(huán)，然后再開始下一個循環(huán)。使用這種泵時一定要連接脈動阻尼器，將產(chǎn)生的脈動除去，若采用雙活塞泵，使雙活塞在相移180°下工作，可使脈動互相抵消，減小噪聲。往復柱塞泵的流量與外界阻力無關(guān)，恒流泵具有體積小的特點，非常適合于梯度洗脫。

（3）螺旋傳動注射泵

螺旋傳動注射泵是用電力以很慢的恒定速率驅(qū)動活塞，使流動相連續(xù)輸出，當活塞到達末端時，輸出中止，然后由另一個吸入沖程使溶劑重新充滿再開始第二次輸出，輸出時間的長短決定于泵腔體積及輸出流量。

3、進樣器

液相色譜儀進樣器普遍使用高壓進樣閥，用微量注射器將樣品注入樣品環(huán)管，使用的樣品環(huán)管分別有不同的尺寸，可根據(jù)分析要求選用。當進樣閥手柄放在吸液位置時，流動相直接通過孔的通路流向色譜柱，樣品通過注射器從另外的位置進入樣品環(huán)管，如果有過量的樣品則會從出口孔排出，然后將手柄轉(zhuǎn)到進樣位置，此時流動相便將樣品帶進色譜柱。

4、色譜柱

色譜柱是整個色譜系統(tǒng)的心臟，它的質(zhì)量優(yōu)劣直接影響到分離的效果。一般情況下色譜柱通常采用不銹鋼管制成，并且柱內(nèi)壁必須光潔平滑，否則內(nèi)壁的縱向溝痕和表面多孔性也會引起譜帶的展寬。柱接頭的體積應盡可能小，柱長一般為10cm~25cm，內(nèi)徑4mm ~5mm。若使用直徑為5μm~10μm固定相顆粒，理論塔板可達到 5×104/m。尺寸排阻色譜柱的內(nèi)徑通常大于5mm，制備色譜柱則會更大；為了減少溶劑用量，可采用微徑柱，內(nèi)徑為1mm，長度為30mm~75mm，若采用3μm顆粒，理論塔板數(shù)高達1×105/m。

為了保護分析柱不被污染，有時需在分析柱前加一短柱，約數(shù)厘米長，此柱稱為保護柱。為了防止保護柱過分增加柱阻力，在保護柱中使用的顆粒大小約為10μm~30μm。

5、檢測器

液相色譜儀常用的檢測器有紫外吸收檢測器、光電二極管陣列檢測器、示差折光檢測器、熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器等。

二、原理

儲液器中的流動相通過高壓泵注入系統(tǒng)，試樣溶液經(jīng)進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱內(nèi)，試樣溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，因此，當兩相相對運動，經(jīng)過反復多次的吸附-解吸分配過程，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。

液相色譜儀常見故障處理

1.氣泡溢出　

流動相內(nèi)有氣泡,關(guān)閉泵,打開泄壓閥,打開purg鍵,清洗脫氣,氣泡不斷從過濾器冒出,進入流動相,無論打開purge鍵幾次,都無法清除不斷產(chǎn)生的氣泡。原因過濾器長期沉浸于乙酸銨等緩沖液內(nèi),過濾器內(nèi)部由于霉菌的生長繁殖,形成菌團,阻塞了過濾器,緩沖液難以流暢地通過過濾器,空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過濾器進入流動相。處理過濾器浸泡于5%硝酸溶液中,超聲清洗幾分鐘即可;亦可將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小時,輕輕震蕩幾次,再將過濾器用純水清洗幾次,打開泄壓閥,打開purge鍵清洗脫氣,如仍有氣泡不斷從過濾器冒出,繼續(xù)將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中,如沒有氣泡不斷從過濾器中冒出,說明過濾器內(nèi)部的霉菌菌團已被硝酸破壞,流動相可以流暢地通過過濾器。打開泄壓閥,打開泵,流速調(diào)至1.0～3.0ml/min,純水沖洗過濾器1小時左右。即可將過濾器清洗干凈。關(guān)閉泄壓閥,純甲醇沖洗半小時即可。

2.柱壓高原因

(1)緩沖液鹽分如(乙酸銨等)沉積于柱內(nèi); 　

(2)樣品污染沉積。處理對于種情況先用40～50℃的純水,低速正向沖洗柱子,待柱壓逐漸下降后,相應提高流速沖洗,柱壓大幅度下降后,用常溫純水沖洗,之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘;對于第二種情況,由樣品的沉積引起污染的C18柱,和純水反向沖洗柱子,然后換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定),再用換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。

3.既無壓力指示,又無液體流過

(1)泵密封墊圈磨損; 　　

(2)大量氣泡進入泵體。處理對于種情況,更換密封墊圈;對于第二種情況,在泵作用的同時,用一個50ml的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。

4.壓力波動大,流量不穩(wěn)定　　

原因系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物,使得兩者不能密封。處理工作中注意觀察流動相的量,保證不銹鋼濾器沉入儲液器瓶底,避免吸入空氣,流動相要充分脫氣。如為單向閥和閥座之間夾有異物,拆下單向閥,放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗。

5.出峰不佳,峰分叉

(1)色譜柱被污染; 　　

(2)柱頭填料塌陷。處理對于種情況,先用純水反向沖洗柱子,然后換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定),再換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳,則考慮第二種情況。對于第二種情況,擰開柱頭,檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷。去除硬結(jié)部分(污染的填料),裝入新填料,滴一滴甲醇,填料下陷,再填,用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊,再填平,滴甲醇,再壓緊反復幾次,直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈,擦凈柱外壁的填料,擰緊柱頭,用純甲醇沖洗30分鐘以上。

6.峰面積重復性不佳

(1)進樣閥漏液?！?/span>

(2)加樣針不到位?！　?/span>

(3)液量不足。     

 處理對于種情況更換進樣閥墊圈;對于第二種情況保證加樣針插到底,注射樣品溶液后須快速、平穩(wěn)地從LOAD狀態(tài)轉(zhuǎn)換到INJECT狀態(tài),以保證進樣量的準確。日常工作中,液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要,如要注意不要讓空氣進入輸液系統(tǒng)和高壓泵中,儲液器內(nèi)的溶液如長時間未用應清洗儲液器并更換溶液,每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈,防止無機鹽析出或沉積;樣品的前處理也很重要,任何樣品都要盡可能地去除雜質(zhì),溶解,盡量減少對色譜柱的污染,以延長色譜柱的使用壽命,同時避免注射過濃的樣品溶液,以免殘留液在進樣閥內(nèi)析出固體引起堵塞;色譜柱作好標記,用于不同分析目的的色譜柱不要混用等。

一、乙腈＆甲醇的性質(zhì)

化學性質(zhì)

乙腈是一種極性的不可電離非質(zhì)子酸，由于存在由于存在C≡N，它可以帶來π-π相互作用，又因為氮原子具有高電負性，它也可以與另一分子形成氫鍵。甲醇是一種極性的可電離質(zhì)子酸，它可以和另一個分子相互作用形成氫鍵。為什么甲醇也可以形成氫鍵呢？因為甲醇上有-OH的存在，氧是高電負性原子，它可以部分極化分子。它在氧上產(chǎn)生微負電荷，在氫原子上產(chǎn)生微正電荷。因此，這個微正電荷的氫原子可以與微負電荷的原子形成氫鍵。

那么什么是極性可電離質(zhì)子溶劑？

極性可電離質(zhì)子溶劑指的是具有氫原子與氧（如羥基）、氮（如胺基）或氟（如）結(jié)合的溶劑。乙腈中存在氫原子，但這些氫原子不與氧形成氫鍵，因此，不能說乙腈是可電離的極性溶劑。而甲醇，氫原子可以與氧形成氫鍵，因此，甲醇是可電離極性溶劑。

截止波長

當使用這些有機溶劑配制流動相，選擇檢測波長時，了解它們的紫外截止波長是非常重要的。乙腈與甲醇相比，它的截止波長更低，約為190nm，而甲醇約為210nm，這意味著使用乙腈時可以在190nm的低波長下進行檢測，但使用甲醇作為有機溶劑，可能無法使用低于210nm的波長，因為此時會產(chǎn)生很多基線噪音。

經(jīng)濟成本

另一個重要因素是甲醇和乙腈的經(jīng)濟成本。乙腈價格高于甲醇，因此當有可能使用甲醇代替乙腈時，可以使用甲醇以節(jié)省實驗室成本。

二、有機溶劑比與柱壓的關(guān)系

我們的HPLC系統(tǒng)一般能承受的背壓約為4000psi，超過這個數(shù)值泵就無法工作。因此，應優(yōu)先選擇產(chǎn)生最小背壓的流動相。有機溶劑和背壓之間存在怎樣的關(guān)系呢？

在上圖中，使用色譜柱：ODS（150mm×4.6mm，5μm），流  速：1.0ml/min，比較了乙腈與水和甲醇與水混合物在不同條件的壓力。由于較高的溫度導致溶劑的粘度降低，壓力也趨向降低。將柱溫設置在25~40℃之間進行比較，我們可以看到甲醇的壓力更高。因此，將流動相中的乙腈替換為甲醇時，需要重新評估儀器系統(tǒng)和色譜柱的耐壓能力。

三、乙腈＆甲醇的溶劑強度比較

圖3 甲醇和丙酮的洗脫強度比較        圖4反相色譜法溶劑強度的線列圖

現(xiàn)在我們來了解一下這兩種重要有機溶劑的強度。圖3展示了使用ODS柱分離對羥基苯甲酸類化合物（即對羥基苯甲酸酯）的一個例子?？梢钥闯霎斠译婧图状家韵嗤谋壤c水混合時，乙腈流動相的洗脫強度更大。圖4中的等效溶劑強度示意圖有助于在這些溶劑之間進行轉(zhuǎn)換時近似計算洗脫強度。例如，如果我們先前使用的是50/50（體積比）的乙腈/水作為流動相，在轉(zhuǎn)換為甲醇時，等效的甲醇/水比例將為60/40（體積比）。圖3中分析的是以下6種分析物：甲基對羥基苯甲酸酯，乙基對羥基苯甲酸酯，異丙基對羥基苯甲酸酯、丙基對羥基苯甲酸酯、異丁基對羥基苯甲酸酯以及正丁基對羥基苯甲酸酯。這些對羥基苯甲酸酯在甲醇中的流動相中，它們都可以被有效地保留，但是當換成到乙腈時，保留時間會大大降低。這個實驗證明了乙腈在反相液相色譜中的洗脫能力更強。

那么為什么甲基對羥基苯甲酸酯會先洗脫出來，而正丁基對羥基苯甲酸酯卻最后才洗脫出來？看一下甲基對羥基苯甲酸酯和丁基對羥基苯甲酸酯的結(jié)構(gòu)，甲基對羥基苯甲酸酯的碳鏈長度較短，而正丁基對羥基苯甲酸酯的碳鏈長度較長。碳鏈長度的變化會影響化合物的非極性，碳鏈較短的化合物非極性較弱，因此在這種情況下，可以清楚地看到正丁基對羥基苯甲酸酯與甲基對羥基苯甲酸酯相比非極性更強。

我們使用的是Shim-Pack ODS色譜柱，C18色譜柱的保留是由疏水或非極性相互作用所決定的。非極性化合物會在C18固定相上相互作用或保留更長時間，在這種情況下，由于正丁基對羥基苯甲酸酯具有更高的非極性特性，它會在C18固定相上保留更長時間。

四、乙腈＆甲醇洗脫選擇性的差異

下一個重要的點是甲醇和乙腈之間的洗脫選擇性不同，我將根據(jù)、苯甲酸和對甲苯酸的洗脫來解釋這兩種不同的選擇性。甲醇的流動相是緩沖液：甲醇（40:60），而乙腈的流動相是緩沖液：乙腈（60:40）。使用的色譜柱是Shim-pack VP-ODS，在這種情況下，我們會發(fā)現(xiàn)用甲醇時，首先洗脫，然后是苯甲酸，最后是對甲苯酸，但是在乙腈的條件下，會發(fā)現(xiàn)苯甲酸首先洗脫，然后是，最后是對甲苯酸。那么為什么用乙腈更容易洗脫苯甲酸呢？是什么使苯甲酸先于洗脫？

在這種情況下，我們需要了解苯甲酸與乙腈之間存在額外的相互作用，即與乙腈的碳氮三鍵和苯甲酸上的羰基氧上的π電子的π-π相互作用。因為甲醇不含π電子，因此這種π-π相互作用在甲醇中是不存在的，但在乙腈中卻很可能發(fā)生，并且由于這種額外的相互作用，苯甲酸將更喜歡存在于乙腈的流動相中。因此，它將隨著流動相一起流動，因此更快地洗脫出來。為什么對甲苯甲酸的保留時間較長？烷基鏈的存在將疏水性帶入分子中，如果疏水性存在，則可以通過疏水相互作用與C18固定相發(fā)生相互作用。現(xiàn)在，在、苯甲酸中沒有烷基鏈的存在，但是在對甲苯甲酸的情況下，有一個甲基鏈，這個甲基鏈帶來了一點疏水性，因此會與C18等疏水性固定相發(fā)生相互作用，這導致對甲苯甲酸與固定相之間有很好的相互作用，因此會保留更長時間。

五、與水混合產(chǎn)生的反應熱

·當甲醇與水混合時，會放出熱量；

·當乙腈與水混合時，會吸收熱量；

·隨著乙腈混合物逐漸回到室溫，液體中會產(chǎn)生氣泡；

·甲醇與水混合時會產(chǎn)生熱量，具有脫氣效果；

·配制水和甲醇混合物作為流動相時需要的關(guān)注比乙腈更少。

免責聲明：本文為轉(zhuǎn)發(fā)內(nèi)容，文本源于網(wǎng)絡，其觀點不代表本平臺觀點與立場，內(nèi)容僅供參考！如有侵權(quán)，請聯(lián)系刪除。