自適應光學的英文名為Adaptive optics，簡稱 AO。 AO是指一系列*的圖像校正技術，已證實對多種生命科學顯微鏡的方法具有優(yōu)勢。然而，傳統(tǒng)AO系統(tǒng)的額外復雜性和成本，使得自適應光學 (AO)無法在顯微鏡中的廣泛應用。 德國Phaseform廠家開發(fā)了折射式、在線的AO系統(tǒng)，可以減少許多復雜的設置和降低成本。

在本應用說明中，我們探討了我們的折射式AO概念如何增強顯微鏡能力，并通過寬視場AO熒光顯微鏡來展示這一點。

圖1:油/水浸泡顯微鏡設置。

自適應光學AO在顯微鏡中的應用

人們常說，從顯微鏡到照相機和望遠鏡，光學成像系統(tǒng)的好壞取決于它們的光學性能。這可能是真的，但圖像的好同時也取決于中間介質好，只有在中間介質允許的情況下，成像質量才會好。

在許多情況下，現(xiàn)代顯微鏡的性能，產(chǎn)生像差的來源有2個方面：其一是：被測樣品和物鏡之間的折射式率不匹配，導致球面像差。其二是：被測樣品的形狀以及折射式率的變化，導致依賴于樣本本身的復雜像差。這種來著像差的“挑戰(zhàn)"在單分子和深層組織的成像中更為嚴峻。如果不加以修正，它們會降低所獲取圖像的對比度和清晰度 [1-2]，阻止顯微鏡達到其理論分辨率。

在過去的二十年里，在顯微鏡中使用自適應光學的廣泛研究已經(jīng)證明了它的有效性。AO可以補償像差并恢復顯微鏡的原始性能，而不受被測樣品和樣品架類型的影響，從而有助于放寬指數(shù)匹配標準并縮短被測樣品制備時間。AO幾乎適用于所有高級顯微鏡技術：共聚焦（confocal,）、寬視場（wide-field）、多光子（multi-photon）甚至超分辨率（super-resolution）方法，比如如 STED、SMS、STORM。特別是對于深層組織成像顯微鏡（一種地允許在自然環(huán)境中檢查細胞的顯微鏡），AO可以在遠低于被測樣品表面的地方保持分辨率。

自適應光學AO的商業(yè)化之路

在專業(yè)的天文學應用中，自適應光學AO子系統(tǒng)無處不在，但是AO自適應光學技術在顯微鏡應用中的發(fā)展很緩慢。這其中的主要原因是，相比于專業(yè)天文學，顯微鏡的成本較低，此外顯微鏡通常在尺寸上小得多，并且由折射式工作原理的透鏡組成。

盡管如此，在的顯微鏡領域一塊，已經(jīng)產(chǎn)生了個把商業(yè)自適應AO系統(tǒng)用于顯微鏡的解決方案。 它們作為顯微鏡擴展端口的附件。在內部結構中，他們通過將光瞳平面?zhèn)鬟f到可變形鏡 (DM) 來執(zhí)行波前測量和校正，并在校正后將光重新引導回顯微鏡的檢測/成像路徑。

但是，這些代產(chǎn)品需要仔細設置，不能普遍兼容，而且依然相對笨重。

圖2:傳統(tǒng)的自適應光學顯微鏡使用可變形的鏡子來施加光路的折疊

圖3:Phaseform為直接集成開發(fā)了在線自適應光學系統(tǒng)

Phaseform 全折射式AO顯微鏡

Phaseform 的愿景是讓大多數(shù)顯微鏡用戶都能使用自適應光學技術。 為了提供具有不妥協(xié)性能的集成、更緊湊的AO解決方案，我們認為，從反射波前調制到折射式波前調制的技術轉變是必要的。因此，我們提出了一種專為顯微鏡設計的新型在線AO系統(tǒng)（圖 3）。

Phaseform的AO顯微鏡是通過以下2點，優(yōu)化了傳統(tǒng)AO系統(tǒng)來實現(xiàn)的：

(A) 可變形反射鏡替換成折射式DPP變形鏡

(B) 省略波前傳感器，改用像差估計算法。

折射式 DPP變形鏡——自適應AO顯微鏡的關鍵技術

Phaseform相位調制變形鏡DPP(Deformable Phase Plate)，如圖 4 所示，是一種新型的動態(tài)光學元件。它的名字來自傳統(tǒng)的變形鏡，一種帶有表面浮雕的透明材料薄板，用于補償高級顯微鏡應用中的固定像差。然而，與那些不同的是，DPP 的表面可以通過跨越通光孔徑的63個致動器陣列動態(tài)地塑造成任何任意形式[3]。 因此，它是可變形反射鏡的折射式替代品。

圖 4：折射式 63個致動器-相位調制變形鏡DPP，能夠校正徑向7階Zernike模式。

DPP相位調制變形鏡 用于顯微鏡的主要優(yōu)點是：

• 透射式：可以插入任何光路中，無需重新計算、重新成像或折疊光路。
• 尺寸緊湊：作為超薄透射元件，DPP變形鏡 從系統(tǒng)的角度來看已經(jīng)提供了空間節(jié)省，但其占用空間小，特別適合集成，甚至可以連續(xù)堆疊多次。
• 高效：它的操作與偏振無關，并且顯示出有限的衍射損耗。
• 多功能：自動校正一階和二階球差和散光對于顯微鏡應用特別有用。 然而，更復雜的像差，例如在深部組織成像中由不同折射式率的區(qū)域導致的像差，需要更高階的校正，DPP 可以提供，類似于DM。
• 動態(tài)：可以在高分辨率成像和顯微鏡設置中實時控制和操作DPP

無波前傳感器的估算法SWE（Sensorless Wavefront Estimation）

光學像差的預知對其校正至關重要。 波前傳感器，例如Shack-Hartmann傳感器或干涉儀，通常用于經(jīng)典AO系統(tǒng)中來測量動態(tài)像差。 然而，使用波前傳感器一方面增加了AO系統(tǒng)的復雜性和成本，同時也不是一個實用的解決方案。尤其是對于顯微鏡應用，可能僅僅是因為顯微鏡設置的限制，甚至是由于所研究標本的性質而受限制。而SWE無波前傳感器估算法（Sensorless wavefront estimation）是一個替代方案，可替代傳統(tǒng)AO顯微鏡中的波前傳感器，在這種情況下，像差動態(tài)是緩慢和相對小的。

SWE算法的兩個一般要求是：

1. 了解樣本或成像目標，從而創(chuàng)建有效的品質因數(shù)，例如圖像清晰度或對比度。這是基于針對波前調制器的不同布置對一系列捕獲圖像進行定量優(yōu)化的實際像差估計，所必需的。
2. 為所采用的波前調制器提供一個可預測的和穩(wěn)健的控制方案。波前調制器需要放在幾個精確的相對配置中，才能有效地實施任何 一種SWE 方法。PhaseformDPP的靜電驅動原理和直觀的控制算法特別適合此類任務[4-5]。

盡管SWE估算法的代價是增加了計算負載，犧牲了圖像采集時間。但通過SWE大大降低了AO系統(tǒng)的硬件復雜性（如下面的案列展示）。此類方法的不同變體的優(yōu)勢已在許多顯微鏡模式中得到證明，例如共聚焦、雙光子熒光、結構化照明、光片、STED 和 SMS [1-2]。

案例展示：即插即用自適應光學顯微鏡

DPP的傳輸工作原理與SWE相結合，使即插即用的AO系統(tǒng)成為可能。與安裝在傳統(tǒng)籠中的透鏡類似，DPP可以插入顯微鏡的光路中，最小到零中斷，以提供系統(tǒng)和樣品引起的像差的動態(tài)校正。圖5描述了Phaseform的Delta 7形式的DPP集成到商業(yè)(圖5a和5b)和定制顯微鏡(圖5c和5d)的4個示例。例子包括熒光寬視場和雙光子顯微鏡成像深入到生物樣品。SWE和DPP的傳輸特性使其易于集成為折光直列系統(tǒng)。

圖5:商用和定制顯微鏡中基于dpp的AO系統(tǒng)的示例。(a)商用顯微鏡物鏡和轉塔之間集成的DPP。(b) DPP集成在商用顯微鏡的共軛瞳孔平面上，使用連接到相機端口的中繼光學器件。(c)用于熒光寬視場成像的“小的AO顯微鏡"[5]。(d)將DPP集成到定制的雙光子顯微鏡的照明路徑中(與Prof。Alexander Jesacher，因斯布魯克醫(yī)科大學)[10]。

AO在顯微鏡中的優(yōu)勢如圖6所示。描述了深入樣品的雙光子成像的實例結果，以及系統(tǒng)和樣品誘導像差的波前無傳感器補償。左邊的(a)列顯示了在沒有和有AO校正的情況下，對超過150 μm深的小鼠腦切片進行神經(jīng)元成像的結果(與因斯布魯克醫(yī)科大學Alexander Jesacher教授小組合作)。柱(b)為球體樣品40 μm深度成像結果。該實驗是在與Prospective Instruments (Stefanie Kiderlen博士和Lukas Krainer博士)合作的雙光子顯微鏡(MPX-1040)中安裝DPP完成的。

圖6:通過(a)定制和(b)商業(yè)獲取的各種樣品的圖像(MPX-1040, Prospective Instruments)使用DPP進行無波前傳感器AO校正的雙光子顯微鏡。

結論

Phaseform認為，折射波前調制器和像差估計算法的進步將改變自適應光學顯微鏡。我們設想一個未來，就像在天文學中發(fā)生的那樣，自適應光學將成為每一臺自建和每一臺商用顯微鏡的默認配置。這個未來可能比我們想象的更近。

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