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酶標(biāo)記抗體法的染色步驟

時(shí)間：2011/12/16閱讀：658
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 （一）直接法
（1）石蠟切片脫蠟至水，冰凍切片或細(xì)胞涂片經(jīng)丙酮固定10min，PBS洗3min×2次。
（2）滴加0．3％Hz02甲醇液，室溫處理20min，PBS洗3min× 3次（抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性）。
（3）0。l％*37~C消化20min或AR（只限于石蠟片），PBS洗3min×3次。
（4）滴加1：（5～20）正常羊血清或牛血清20min（室溫或37℃），吸去多余血清，不洗。
（5）適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)記特異性抗體（一抗）孵育60min 37℃，PBS洗3min×3次。
（6）0．04％DAB+0．03％Hz02顯色8—12rain，在光鏡下控制。
（?）充分水洗，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化15～30s。
（8）常規(guī)樹(shù)膠封片，結(jié)果觀(guān)察。

（二）間接法
（1）～（3）同直接法。
（4）第二抗體的正常動(dòng)物血清1：20，室溫20min（阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)），傾去多余血清，不洗。
（5）適當(dāng)稀釋的特異性抗體（一抗）濕盒37℃中孵育60min，或室溫孵育4h，或4℃孵育過(guò)夜，PBS洗3min×3次。
（6）酶標(biāo)記抗體（二抗）37℃孵育40min，PBS洗3rain×3次
（7）DAB／Hz02顯色8～12rain，鏡下控制。
（8）以下同直接法。

（三）三步酶標(biāo)間接法
三步酶標(biāo)間接法是在酶標(biāo)間接法的基礎(chǔ)上再加一步酶標(biāo)記三抗，信號(hào)進(jìn)一步放大，使敏感性進(jìn)一步增加。第三步酶標(biāo)記三抗必須是抗第二步酶標(biāo)記二抗，例如第三步酶標(biāo)記二抗是兔抗鼠，第三步酶標(biāo)記三抗應(yīng)該是羊抗兔酶標(biāo)抗體。另外，第二步和第三步酶標(biāo)抗體所用的酶必須是同一種酶。

（四）酶標(biāo)記抗原法
該方法僅用一種特異性抗體，抗體必須過(guò)量。其原理是抗體中二個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)（二價(jià)）分別與組織細(xì)胞內(nèi)的抗原和酶標(biāo)記抗原結(jié)合，原理見(jiàn)圖4—6。該法的zui大的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)抗體的特異性和純度要求不高，可以非常穩(wěn)定地進(jìn)行IHC的雙重標(biāo)記，標(biāo)記二種抗原。
 

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