1、基本原理

　　酶標抗體技術(shù)是通過共價鍵將酶連接在抗體上，制成酶標抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，于普通顯微鏡或電鏡下進行細胞表面及細胞內(nèi)各種抗原成分的定位，根據(jù)酶標記的部位可將其分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋聯(lián)法（多步法）等，用于標記的抗體可以是用免疫動物制備的多克隆抗體或特異性的單克隆抗體，是特異性強的價的單克隆抗體。直接法是將酶直接標記在*抗體上，間接法是將酶標記在第二抗體上，檢測組織細胞內(nèi)的特定抗原物質(zhì)。目前通常選用免疫酶組織化學(xué)間接染色法。

　?。?）標本的制備和處理

用于酶標抗體組化技術(shù)的標本有組織切片（冷凍切片和石蠟切片）、組織壓印片。標本的制作和固定與熒光抗體技術(shù)相同，但尚需要一些特殊處理。

　　（2）標記酶

　　用于標記的酶應(yīng)具備以下幾點：

　?、?酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，所形成的產(chǎn)物易于在光鏡或電鏡下觀察。

　?、?所形成的終產(chǎn)物沉淀必須穩(wěn)定，即終產(chǎn)物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學(xué)定位。

　?、?較易獲得的酶分子，有商品出售。

　?、?中性 pH 時，酶應(yīng)穩(wěn)定，酶標記抗體后，保存 1-2 年活性不應(yīng)改變，且酶的催化活性（ Turnover ）越高越好。

　　⑤ 酶標過程中，酶與抗體連接，不能影響二者的活性。

　?、?被檢測組織中，不應(yīng)存在與標記酶相同的內(nèi)源性酶或類似物質(zhì)。

　　其中 ① 、② 兩點zui重要，因為容易顯示的酶并非均能形成不可溶性的復(fù)合物。一般認為，辣根過氧化物酶（HRP）較佳，是zui常用的一種酶。

　　除 HRP 外，堿性磷酸酶（ALP）和葡萄糖氧化酶（GOD）也較常用。

　?。?）底物顯色劑

　　① DAB （3，3-二氨基聯(lián)*）：顯色后陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色。

　?、?AEC （3，氨基-9- 乙基卡巴唑）：顯色后陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈紅色或紫紅色。

　　2、以 PRRSV 為例介紹一下染色程序。

　?。?）切片準備：將低溫保存的切片37 ℃預(yù)熱 5分鐘 。

　　（2）常規(guī)脫蠟： 二甲苯15分鐘； 乙醇 5分鐘；乙醇1分鐘；90% 乙醇 1分鐘；75% 乙醇 1分鐘。

　?。?）抑制內(nèi)源酶：1% 鹽酸酒精（75% 乙醇 99mL 加 1mL 鹽酸）作用10分鐘； 3%*水溶液作用15分鐘。

　?。?）蒸餾水洗 2 次。

　　（5）用 0.05% *37 ℃消化2分鐘。

　?。?）PBS洗2次，擦干周圍后用組化（蠟）筆沿切片周邊畫一個圈 。

　?。?）封閉：正常馬血清1：20倍稀釋， 37 ℃ 孵育20分鐘。

　?。?）加一抗（1 : 800倍稀釋的PRRSV單克隆抗體 Mab 11），37 ℃孵育1小時或37 ℃孵育0.5小時后4 ℃過夜。對照片不加一抗。

　　（9）PBS 洗 3 次。

　　（10）加二抗（HRP 標記的羊抗鼠 IgG 1 : 100X 稀釋）37 ℃孵育1小時。

　?。?1）PBS洗3 次。

　?。?2）加AEC顯色5~10分鐘。

　　（13）蘇木素襯染10秒鐘。

　?。?4）自來水洗2分鐘。

　?。?5）待切片自然干燥后用水溶性封片劑封片。

　?。?6）鏡檢、觀察記錄結(jié)果。