考馬斯亮藍法測定蛋白質含量流程

時間：2013/5/23閱讀：1867

考馬斯亮藍法測定蛋白質含量流程

　　該方法用于大多數(shù)蛋白質的定量是比較的，但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖核酸酶或*。去污劑的濃度超過0．2％影響測定結果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。

　　1．Bradford濃染液的配制：將100rug考馬斯亮藍G-250溶于50m1 95％乙醇，加入100ml濃磷酸，然后，用蒸餾水補充至200ml，此染液放413至少6個月保持穩(wěn)定。

　　2．標準曲線蛋白質樣本的準備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標準品，例如測定抗體，可用純化的抗體作為標準。如果待測樣本是未知的，也可用抗體作為標準蛋白。通常在20ug—150ug／100ul之間繪制標準曲線。

　　3．將待測樣本溶于100~1緩沖溶液中，該緩沖溶液應與制作標準曲線的緩沖溶液相同（用PBS）。

　　4．按1：5用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，如出現(xiàn)沉淀，過濾除去。

　　5．每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30rain。染液與蛋白質結合后，將由紅色變?yōu)樗{色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min．

　　6．根據(jù)標準曲線計算待測樣本的濃度。

考馬斯亮藍和皮膚中蛋白質通過范德華力結合，反應快速，并且穩(wěn)定，無法用普通試劑洗掉。待一兩周左右，皮屑細胞自然衰老脫落即可無礙。

考馬斯亮藍R-250是電泳的

考馬斯亮藍G250和R250都可以染蛋白，一般用R250，G250染色后背景較深不易脫色。一般R250 染蛋白，G250 一般測蛋白濃度，也可染膠，敏感性更高但較慢脫色較難。

考馬斯亮藍G250常用的蛋白染料，作定性試驗用,染色后為藍綠色;R250較敏感,做定量實驗用,染膠效果較好.染色后為紅藍色。

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