克倫特羅酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒使用說明書
概述:
克倫特羅（Clenbuterol）屬于一類β-興奮劑，具有改進(jìn)脂肪型動物體內(nèi)肉與脂肪的比例的作用，亦可促進(jìn)動物生長。但同時，此藥物還會使非橫紋肌松弛，人體攝入后可引起心跳、心率不正常等副反應(yīng)，甚至可導(dǎo)致心臟病。因此在我國，克倫特羅在畜牧業(yè)上的使用是被嚴(yán)格禁止的。
本試劑盒利用競爭酶聯(lián)免疫法對生物樣品中的克倫特羅進(jìn)行定量分析。適用于動物尿液、血清、內(nèi)臟等物質(zhì)中克倫特羅的快速檢測。由于ELISA法的高通量與簡便快速，適合大量樣本的定量篩查，自樣本加入至結(jié)果讀出，不超過60分鐘，檢測靈敏度為0.1ppb。
一、 簡要原理
試劑盒所提供的微孔板上包被有抗體，然后將校準(zhǔn)品或樣本中的克倫特羅與酶標(biāo)記的克倫特羅加入微孔中后，兩者可競爭結(jié)合克倫特羅抗體，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)記克倫特羅。加入底物后，在酶作用下，底物溶液會顯藍(lán)色，加入終止劑后，溶液由藍(lán)轉(zhuǎn)為金黃色。在450nm波長光下測吸光度，吸光度高低與校準(zhǔn)品或樣品中克倫特羅的含量呈反比，根據(jù)校準(zhǔn)品的讀數(shù)作出校準(zhǔn)曲線，并利用校準(zhǔn)曲線計算出樣品中克倫特羅的含量。
二、 試劑盒組成
1. 酶標(biāo)反應(yīng)板： 96孔易折板，抗體已包被
2. 克倫特羅校準(zhǔn)品： 1ml/瓶×6瓶 濃度：0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb
3. 11×酶標(biāo)記克倫特羅濃縮液： 1.2ml/瓶×1瓶（稀釋11倍使用）
4. 底物液： 11ml/瓶×1瓶
5. 酶標(biāo)稀釋液： 20ml/瓶×1瓶
6. 50×濃縮洗滌液： 20ml/瓶×1瓶（稀釋50倍使用）
7. 終止劑： 11ml/瓶×1瓶
8. 其他： 說明書×1份 自封袋×1個
2-8℃貯存，有效期一年
三、 實驗需要但試劑盒不提供的試劑和儀器
1. 試劑
――――――10mM鹽酸溶液
――――――氯化鈉
――――――50mM PH7.0 PBS （配制:9g NaCl；4.65g Na2HPO4·12H2O；0.56g NaH2PO4·2H2O 溶解于1000ml蒸餾水中）
――――――異丙醇
――――――乙酸乙酯
2 .儀器
――――――微孔板酶標(biāo)儀
――――――渦旋振蕩器或超聲波粉碎儀
――――――離心機
――――――20μl、200μl、1ml移液器
――――――氮吹儀或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀
四、 待測樣品處理方法
1. 尿液
新鮮尿液可直接測定，如尿液混濁，則離心取上清進(jìn)行檢測。（如尿液中克倫特羅含量超出試劑盒線性范圍,可用蒸餾水或50mM PH7.0的PBS對尿液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再行檢測）
2. 肉樣及內(nèi)臟組織
1）.稱取肌肉或內(nèi)臟樣本10g，用20ml 10mM鹽酸溶液勻漿，置于離心管中，充分振蕩混勻5min或超聲混勻5min,再靜置10分鐘。之后10000rpm離心10min或4500rpm離心20min（離心溫度保持在10℃左右）。收集澄清的上清液（注意勿吸取脂肪層），可直接用于檢測。（相當(dāng)于0.5g樣品/ml）
2）.若要獲得更高的檢測靈敏度，可在離心后收集所有上清，加入氯化鈉固體至0.32g/ml，可能會有沉淀或乳化現(xiàn)象產(chǎn)生，請勿離心!將2ml上清轉(zhuǎn)移至玻璃離心管中，加入4ml異丙醇+乙酸乙酯（2+3），充分振蕩混勻5分鐘,靜置15分鐘。提取完畢，3000r/min離心10min，將2ml上層有機相轉(zhuǎn)移至玻璃試管中，用氮吹儀60℃吹干有機相，然后加入一定量的蒸餾水或 50mM PH7.0的PBS溶液將殘留物溶解，待檢（若復(fù)溶體積為0.5ml,則相當(dāng)于1g樣品/ml）
3. 動物飼料
稱取5.0g研碎的飼料樣品，加入10ml 5mM HCL，置于離心管中充分振蕩混勻5min或超聲混勻5min，再靜置10分鐘。之后10000rpm離心10min或4500rpm離心20min（離心溫度保持在10℃左右），轉(zhuǎn)移出上清液，可直接用于檢測。
若要獲得更高的檢測靈敏度，可按“肉樣及內(nèi)臟組織”處理方法2）.中所述進(jìn)行處理。（如*按前述處理,則復(fù)溶體積為0.5ml時，相當(dāng)于1g樣品/ml）
五、 試劑準(zhǔn)備
1. 實驗前準(zhǔn)備
將試劑盒取出，室溫（20-25℃）放置30分鐘，使試劑盒回溫。
2. 酶標(biāo)記克倫特羅工作液準(zhǔn)備
由于稀釋后的酶標(biāo)記克倫特羅工作液穩(wěn)定性較差，所以請從試劑盒中取出所需量的酶標(biāo)記克倫特羅濃縮液，用酶標(biāo)稀釋液以1:11的比例稀釋濃縮酶標(biāo)記液（例如80μl濃縮液+800μl樣品稀釋液）。
3. 洗滌液配制
取出所需量的濃縮洗滌液，加入49倍體積的蒸餾水，即成洗滌工作液（例如10ml濃縮液+490ml蒸餾水）
六、 操作步驟
1. 從錫箔袋中取出所需的微孔板條，將暫時不用的微孔板條放回帶有干燥劑的錫箔袋中，并用試劑盒附帶的自封袋封存。
2. 在一個微孔中加入150μl蒸餾水作為空白對照。
3. 其余各微孔中加入50μl克倫特羅校準(zhǔn)液或已完成前處理的待測樣品。
注意：加入校準(zhǔn)液順序為按照濃度從低到高加入，以避免校準(zhǔn)液濃度出現(xiàn)偏差。
4. 每孔（除空白對照孔以外）加入100μl酶標(biāo)記克倫特羅工作液（配制方法見五-2）
注意：在試劑加入過程中，請避免移液器滴頭接觸已加入的校準(zhǔn)液或待測樣品，防止孔間交叉污染；避免在加樣過程中產(chǎn)生氣泡。
5. 振蕩混勻反應(yīng)液，于20-25℃環(huán)境下放置30分鐘（建議使用25℃恒溫箱）。
6. 取出微孔板，傾空液體，每孔加入400μl洗滌液，輕輕振蕩，靜置片刻，傾去洗滌液，重復(fù)4次。zui后在吸水紙上將微孔板拍干。
7. 每孔加入100μl的底物液，20-25℃避光環(huán)境下放置20分鐘（建議使用25℃恒溫箱）。
8. 取出微孔板，每孔加入100μl反應(yīng)終止液，充分混勻（微孔中切忌存在氣泡），用酶標(biāo)儀在450nm下讀數(shù)，扣除空白，并繪制校準(zhǔn)曲線。
七、 結(jié)果判定
1. 樣本中的克倫特羅含量可以通過在半對數(shù)坐標(biāo)紙木上手工繪制校準(zhǔn)曲線來進(jìn)行定量計算；或者應(yīng)用合適的計算繪圖軟件繪制出校準(zhǔn)曲線，得出公式，并計算樣品中的克倫特羅濃度。
2. 先將除空白孔外的所有測定孔扣除空白對照的吸光度。然后將扣除空白后的校準(zhǔn)品孔吸光度值 （B） 除以扣除空白后的陰性對照孔吸光度值 （B0） ，再乘以，即：
以所對應(yīng)的校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制出校準(zhǔn)曲線。
3. 用上述方法，同樣地得出對于樣本測定孔的y值，代入校準(zhǔn)曲線，即可計算出相應(yīng)樣本的克倫特羅濃度值。以下為校準(zhǔn)曲線的一個示意圖：
八、 試劑盒相關(guān)方法學(xué)數(shù)據(jù)
1. 試劑盒靈敏度
本試劑盒靈敏度為0.1ppb
2. 試劑盒半抑制率
本試劑盒半抑制率約在0.7～1.0ppb左右
3. 試劑盒的重復(fù)性
對不同濃度的校準(zhǔn)品進(jìn)行8次重復(fù)測定，獲得每個濃度所對應(yīng)的OD450值，計算變異系數(shù)，結(jié)果如下：
4. 試劑盒線性范圍
本試劑盒在0.2ppb～4ppb區(qū)間呈線性相關(guān)。
5. 添加回收實驗的回收率
以豬尿為例，回收率在80～120%之間。
6. 交叉反應(yīng)
結(jié)構(gòu)類似物 交叉反應(yīng)率
* 3.5%
特普他林 1.2%
異丙基腎上腺素 <0.1%
九、 實驗中注意事項
1. 在試驗前將所有試劑預(yù)熱至室溫。
2. 試劑加入各微孔的時間差越小越好，如果檢測樣本較多，建議使用多孔移液器。
3. 操作過程中手盡量少接觸酶標(biāo)板底部，并且在讀數(shù)前用軟紙輕輕擦去底部可能附著的水珠或指痕。
4. 在加入反應(yīng)終止液后1小時內(nèi)讀數(shù)。
5. 本實驗可采用單孔或平行雙孔定量測定，但雙孔定量更準(zhǔn)。
6. 反應(yīng)終止液為強酸物質(zhì)，避免接觸皮膚或衣物。
7. 不要使用過期試劑，不要將不同批號試劑混用，否則會造成靈敏度降低。
