【實驗目的和意義】

生長在干旱和鹽度環(huán)境中的植物，體內(nèi)常積累游離的氨基酸，而游離氨基酸積累的量又往往與環(huán)境干旱的程度、鹽度和植物對干旱和鹽度的抵抗力（即抗逆性）有關。因而，測定植物體內(nèi)游離脯氨酸的含量，在一定程度上可從生理上了解植物受環(huán)境水分和鹽度脅迫的情況，了解植物對水分和鹽分脅迫的耐受性和抵抗能力，在生產(chǎn)上和育種學上有一定的意義。

【實驗原理】

磺基水楊酸對脯氨酸有特定反應，當用磺基水楊酸提取植物樣品時，脯氨酸便游離于磺基水楊酸溶液中。然后用酸性茚三酮加熱處理后，茚三酮與脯氨酸反應，穩(wěn)定的紅色化合物，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下測定吸光度，即可從標準曲線上查出脯氨酸的含量。

【實驗材料】

充足供水的小麥幼苗

干旱處理7天的小麥幼苗

經(jīng)100mmol/L NaCl處理5天的小麥幼苗

經(jīng)200mmol/L NaCl處理5天的小麥幼苗

【實驗器材和試劑】

分光光度計；電子分析天平；離心機；小燒杯；普通試管；移液管；注射器；恒溫水浴鍋；漏斗；漏斗架；濾紙；剪刀；洗耳球。

    2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20mL 6mol/L磷酸中，攪拌加熱（70℃）溶解，貯于冰箱中。

    3％磺基水楊酸配配制：3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100mL。

   10μg/mL脯氨酸標準母液配制：稱取20mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度（為100μg/mL脯氨酸母液），再吸取該溶液10ml, 加蒸餾水稀釋定容至100mL, 即為10μg/mL脯氨酸標準液。

   冰醋酸。

   甲苯。

【實驗步驟】

脯氨酸標準曲線的制作

           取6支試管，編號，按下表配制每管含量為0～20μg的脯氨酸標準液。

           混勻后，置于沸水浴上加熱30min，冷卻。

           各試管加入5mL甲苯，振蕩30秒鐘，靜置片刻，使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。

           以甲苯溶液為空白對照，在520mm波長處測定吸光度（A）值。以脯氨酸含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

樣品的測定

   稱取不同處理的植物葉片各0.5g，分別置大試管中，然后向各管分別加入5ml 3％的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取過程中要經(jīng)常搖動），冷卻后過濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。

    吸取2ml提取液于帶玻塞試管中，加入2ml冰醋酸及2ml 2.5﹪酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱30min，溶液即呈紅色。冷卻后加入5ml甲苯，搖蕩30秒鐘，靜置片刻后，測定萃取液在520nm處的吸光值。

【結果計算】

從標準曲線上查出樣品測定液中脯氨酸的含量，按下公式計算樣品中脯氨酸含量：

                                      X   ×    提取液總量（mL）

脯氨酸含量（μg/g）＝ ———————————————————

                                       樣品鮮重（g）× 測定時提取液用量（mL）

公式中：X －從標準曲線中查得的脯氨酸量（μg）.

【注意事項】

配置的酸性茚三酮溶液僅在24 h內(nèi)穩(wěn)定，因此現(xiàn)用現(xiàn)配。

試劑添加次序不能出錯。

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6.提供蛋白酶抑制劑，使在細胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害。