杭州麥哲儀器有限公司
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閱讀：724發(fā)布時(shí)間：2013-6-13
慈姑又名燕尾草、剪刀草，為澤瀉科多年生水生草本植物，《本草綱目》收載品種，原產(chǎn)我國，喜溫和充足的陽光，常利用低洼水田種植。慈姑含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，每100g鮮慈姑中含碳水化合物15.4g，蛋白質(zhì)5.4g，脂肪0.3g，還含有Ca、P、Fe、Zn、Cu等礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，以及VC、VE和硒等抗氧化成分。因此，本試驗(yàn)以大理產(chǎn)慈姑為原料經(jīng)水提醇沉提取提得粗多糖，再經(jīng)SEVag脫蛋白后得精制慈姑多糖，并用微量凱氏定氮法測(cè)定粗多糖和精制多糖中蛋白質(zhì)含量。此方法，準(zhǔn)確度高，誤差小于±2%，蛋白質(zhì)含量的測(cè)定可以直接使用蛋白質(zhì)測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定分析。
1.1 材料
新鮮慈姑購于云南大理市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，產(chǎn)于云南省大理市鳳儀鎮(zhèn)，新鮮慈姑洗凈，切片曬干，粉碎備用。石油醚（沸程60～90℃）、無水乙醇、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、*、鹽酸、溴甲酚綠、甲基紅等，均為分析純。
1.2
主要儀器
型電子分析天平；數(shù)顯恒溫水浴鍋；低速離心機(jī)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，凱氏定氮儀，酸堿滴定管等。
2 方法
2.1慈姑多糖的提取
稱取慈姑粉200g中加入10倍體積的石油醚于回流裝置中，60℃回流3ｈ，過濾，濾渣晾干，用10倍體積80%乙醇80℃回流2ｈ，以除去單糖、多酚、低聚糖和甙類小分子物質(zhì)，過濾，濾渣晾干得脫脂慈姑樣品。稱取脫脂慈姑樣品2份，每份100g，按料液比1∶15（g/ml）加入蒸餾水，于70℃水浴浸提3ｈ，過濾，濾渣重復(fù)浸提1次，合并提取液，適當(dāng)濃縮，加入95%的乙醇，使乙醇終濃度達(dá)80%。充分?jǐn)嚢韬?℃下靜置24ｈ，離心收集沉淀。一份沉淀真空干燥，得慈姑多糖粗品；另一份溶于少量蒸餾水中，用SEVagE法（多糖溶液∶氯仿∶正丁醇＝25∶5∶1）脫蛋白，反復(fù)進(jìn)行至無蛋白層后，取水層加入95%的乙醇，使含醇量達(dá)到80%，充分?jǐn)嚢韬?℃下靜置24ｈ，離心收集沉淀，并用無水乙醇、乙、丙酮反復(fù)洗滌多次，真空干燥，得慈姑多糖精品。
2.2 慈姑多糖中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定
2.2.1 消化
準(zhǔn)確稱取烘干至恒重的慈姑多糖樣品5.0g加去離子水定容50ml為待測(cè)樣品溶液。0.5g?。?SＯ4加入消化管底部，加2～3粒小玻珠（防沸），加入1ml待測(cè)樣品溶液及2ml消化液（2%ＣｕSＯ4溶液與濃Ｈ2SＯ4按體積比為1∶4的混合溶液），輕輕搖勻后將消化管放在有鐵絲籮的電爐上，在瓶口倒置一漏斗，放在通風(fēng)櫥中，電爐直接加熱進(jìn)行消化，在消化過程中時(shí)常轉(zhuǎn)動(dòng)消化管，使全部樣品都浸泡在硫酸溶液中，以保證樣品消化*。消化液褪色消失，呈現(xiàn)淡綠色時(shí)消化即告完畢。為了保證消化的*完成，在溶液透明后繼續(xù)加熱1ｈ，冷卻至室溫。同時(shí)以1ml去離子水代替待測(cè)樣品溶液同樣操作做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
2.2.2 蒸餾
裝好定氮蒸餾裝置，于水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)裝水約2/3處，加甲基紅指示劑數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性，再加入數(shù)粒玻璃珠以防暴沸，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水，經(jīng)水蒸氣洗滌裝置10min至10ml 2%硼酸指示劑混合液不變色，表示儀器已經(jīng)洗滌干凈。量取2%硼酸吸收液10ml置150ml的錐形瓶?jī)?nèi)，滴加混合指示液1～3滴，并使冷凝管下端插入液面下，將樣品消化管內(nèi)的樣品由小玻璃杯流入凱氏蒸餾器內(nèi)，用約20ml蒸餾水沖洗消化管及小玻璃杯3次，使洗滌液流入反應(yīng)器內(nèi)，塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。再將8ml 50%*溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其緩慢流入反應(yīng)室，立即將玻璃蓋塞緊，并加蒸餾水于小玻璃杯作水封以防漏氣。夾緊夾子，開始蒸餾，蒸氣通入反應(yīng)室使氨通過冷凝管進(jìn)入接收瓶?jī)?nèi)。從第1滴蒸餾液滴下起計(jì)時(shí)，蒸餾5min后，移動(dòng)接收瓶，使冷凝管下端離開液面，再蒸餾1min，使氨全部蒸出，可用精密ｐＨ試紙測(cè)冷凝管口的冷凝液來測(cè)定蒸餾是否完畢，中性則說明已蒸餾*。然后用少量去離子水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶。同時(shí)空白管按上述方法操作。
2.2.3滴定
全部蒸餾完畢后，用0.01mol/Ｌ鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定上述餾出液，直至硼酸混合指示劑由綠色變回淡紫紅色，即為滴定終點(diǎn)。記錄鹽酸溶液體積的消耗量，平行做五組，取平均值；同時(shí)做一空白對(duì)照。
2.2.4 計(jì)算
蛋白質(zhì)（%）＝Ｃ×（V1－V2）×Ｍ/Ｎｍ×1000×Ｆ×100
式中：Ｃ為鹽酸溶液的濃度（mol/Ｌ）；V1為滴定樣品吸收液時(shí)消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（ml）；V2為滴定空白吸收液時(shí)消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（ml）；Ｆ為蛋白質(zhì)系數(shù)（6.25）；ＭＮ為氮的摩爾質(zhì)量（14.01g/mol）；ｍ為稱量樣品的質(zhì)量（g）。
3 結(jié)果
結(jié)果慈姑粗多糖中蛋白質(zhì)含量為5.80%，經(jīng)SEVag脫蛋白后的慈姑多糖中蛋白質(zhì)含量為2.67%。原因是SEVag法適用于游離蛋白的去除，但無法除去多糖中的游離蛋白。因此，經(jīng)水提醇沉法所得的慈姑多糖中除了游離蛋白外，還含有較多的結(jié)合蛋白，游離蛋白和結(jié)合蛋白含量分別為3.13%、2.67%。
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