蛋白質技術專題：凝膠過濾層析實驗
閱讀：138發(fā)布時間：2022-4-30
凝膠過濾層析（gel filtration chromatography）法又稱排阻層析或分子篩方法，主要是根據蛋白質的大小和形狀，即蛋白質的質量進行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖類物質，使蛋白質混合物中的物質按分子大小的不同進行分離。
實驗方法
蛋白質的凝膠過濾分離
實驗材料 蛋白質
試劑、試劑盒 凝膠過濾緩沖液
儀器、耗材 布氏漏斗 凝膠過濾層析柱 分光光度計
實驗步驟
1. 如果凝膠過濾的介質是干粉，則需在凝膠過濾緩沖液中*溶脹。
2. 在遠離過往通道及直接光照的恒溫環(huán)境，將層折柱垂直安裝在穩(wěn)固的實驗室支架上。
3. 用一注射器將凝膠過濾緩沖液從柱子的輸出管注入柱子，至緩沖液達到柱子支持體平面之上，注射器留在輸出端以堵住柱子。
4. 沿著一根順柱子內壁而放的玻璃棒將凝膠混懸物倒入柱子至所設高度，再小心往凝膠頂部加入1 cm 高的一層緩沖液，并連接緩沖液貯存容器，取去堵著柱子輸出管的注射器，用2~3倍柱床體積的緩沖液請洗柱子。
5. 流盡柱子凝膠頂部上面的緩沖液、關閉其輸出管。
6. 加入相當于柱床體積1%~5%的蛋白質樣品。開放輸出管，讓樣品流進柱床，凝膠上面的柱子內壁以緩沖液沖洗。
7. 在凝膠頂上用吸管加入1 cm 高的緩沖液層，重新與緩沖液貯存容器連接，開始洗脫。
8. 分部收集流出液。每分部相當于1%總柱床體積，分別測每個分部的A280，并各取小份樣品測生物活性，選出有活性的分部用SDS-PAGE檢測所含蛋白質的數量和質量，合并含目標蛋白的分部。
9. 用2~3個柱床體積的凝膠過濾緩沖液洗柱，柱子保存在含0.02%疊氮鈉的緩沖液中，柱于可無限次地使用。
收起
注意事項 切勿用磁力攪拌器攪拌，讓凝膠顆粒自然沉降，吸去或傾去不沉降的細小顆粒，或者根據廠商的使用指南進行處理，對預溶脹的凝膠，在布氏漏斗或玻璃燒結漏斗中用大量緩沖液冼去防腐劑，重懸于等體積的凝膠過濾緩沖液，傾入*過濾瓶中，在使用前進行脫氣。
