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PCR應(yīng)該注意的事項(xiàng)

閱讀：379發(fā)布時(shí)間：2022-5-1

出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：是引物與靶序列不*互補(bǔ)、或引物聚合形成聚體。是Mg2+離子濃度過、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另來(lái)源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提退火溫度或采用溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。

出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過，Mg2+濃度過，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

克隆PCR產(chǎn)物1)克隆PCR產(chǎn)物的條件是什么？
摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。應(yīng)測(cè)定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時(shí)，或4℃過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會(huì)自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時(shí)能滿足大多數(shù)克隆要求，為提連接效率，需4℃過夜。

2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？
如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的聚體。少量的引物聚體的摩爾數(shù)也很，這會(huì)產(chǎn)生比例的帶有引物聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。

3)如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)？
A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。
如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。
B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù)，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率。
例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化率為：產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。
鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉(zhuǎn)化率為：
1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞
如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。
C）如用pGEM-T正對(duì)照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑（用步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去T?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無(wú)核酸酶污染，不應(yīng)用其它來(lái)源的T4 DNA連接酶替換。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對(duì)照，轉(zhuǎn)化頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cfu/ug）,按照的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個(gè)菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。

4)對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問題？
A）連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿足大多數(shù)克隆，為提效率，需4℃過夜。
B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-T正對(duì)照混合，再連接。如降低了對(duì)照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時(shí)有發(fā)生。UV過度照射會(huì)產(chǎn)生嘧啶聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。
D）帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無(wú)A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料（TM042）。
E）度重復(fù)序列可能會(huì)不穩(wěn)定，在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細(xì)胞

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