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閱讀：809發(fā)布時(shí)間：2016-1-28
基本概念
原理：將待檢測(cè)的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過(guò)堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。
用途：檢測(cè)樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。
實(shí)驗(yàn)步驟
一、基因組DNA的制備
二、基因組DNA的限制酶切
根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定酶切DNA的量。一般Southern雜交每一個(gè)電泳通道需要10-30μg的DNA。購(gòu)買的限制性內(nèi)切酶都附有相對(duì)應(yīng)的10倍濃度緩沖液，并可從該公司的產(chǎn)品目錄上查到消化溫度。為保證消化*，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。消化的DNA濃度不宜太高，以0.5μg /μl 為好。具體操作如下：在1.5ml離心管中依次加入
DNA（1μg /μl） 20 μg
10×酶切buffer 4.0 μl
限制性內(nèi)切酶（10U/μl） 5.0 μl
加ddH2O 至 500 μl
在zui適溫度下消化1-3hour。消化結(jié)束時(shí)可取5μl電泳檢測(cè)消化效果。若消化效果不好，可以延長(zhǎng)消化時(shí)間，但超過(guò)6hour已沒有必要?；蛘叻糯蠓磻?yīng)體積，或者補(bǔ)充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA樣品中有太多的雜質(zhì)，或酶的活力下降。
消化后的DNA加入1/10 體積的0.5M EDTA，以終止消化。然后用等體積酚抽提、等體積氯仿抽提，2.5倍體積乙醇沉淀，少量TE溶解。
如果需要兩種酶消化DNA，而兩種酶的反應(yīng)條件可以一致，則兩種酶可同時(shí)進(jìn)行消化；如果反應(yīng)條件不一致，則先用需要低離子強(qiáng)度的酶消化，然后補(bǔ)加鹽類等物質(zhì)調(diào)高反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度，再加第二種酶進(jìn)行消化。
三、基因組DNA消化產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳是目前分離核酸片段zui常用的方法，制備簡(jiǎn)單，分離范圍廣（200bp-50kb），實(shí)驗(yàn)成本低。下表列舉了不同濃度瓊脂糖凝膠能分離的DNA片段范圍。
表：不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA片段的范圍
瓊脂糖凝膠濃度（%） | 分離DNA片段范圍（kb）表：不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA片段的范圍 |
0.3 | 5-60 |
0.6 | 1-20 |
0.7 | 0.8-10 |
0.9 | 0.5-7 |
1.2 | 0.4-6 |
1.5 | 0.2-3 |
2.0 | 0.1-2 |
1. 制備0.8%凝膠：一般用于Southern雜交的電泳膠取0.8%。
2. 電泳：電泳樣品中加入6×Loading 緩沖液，混勻后上樣，留一或兩泳道加DNA Marker。1-2V/cm，DNA從負(fù)極泳向正極。電泳至溴酚藍(lán)指示劑接近凝膠另一端時(shí)，停止電泳。取出凝膠，紫外燈下觀察電泳效果。在膠的一邊放置一把刻度尺，拍攝照片。正常電泳圖譜呈現(xiàn)一連續(xù)的涂抹帶，照片攝入刻度尺是為了以后判斷信號(hào)帶的位置，以確定被雜交的DNA長(zhǎng)度。
四、轉(zhuǎn)膜
轉(zhuǎn)膜就是將瓊脂糖凝膠中的DNA 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜（NC膜）或尼龍膜上，形成固相DNA。轉(zhuǎn)移的目的是使固相DNA與液相的探針進(jìn)行雜交。轉(zhuǎn)膜時(shí)可根據(jù)不同需要選擇不同的固相支持物用于雜交。。常用的轉(zhuǎn)移方法有鹽橋法、真空法和電轉(zhuǎn)移法。
五、探針標(biāo)記
進(jìn)行Southern 雜交的探針一般用放射性物質(zhì)標(biāo)記.而探針的標(biāo)記方法有隨機(jī)引物法、切口平移法和末端標(biāo)記法，有一些試劑盒可供選擇，操作也很簡(jiǎn)單。
例：
1. 取25-50ng模板DNA于0.5ml離心管中，100℃變性5min，立即置冰浴。
2. 在另一個(gè)0.5ml離心管中加入：
Labeling 5×buffer （含有隨機(jī)引物） 10μl
dNTPmix (含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM) 2μl
BSA（小牛血清白蛋白） 2μl
[a-32P]dATP 3μl
Klenow酶 5U
3. 將變性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl，混勻。室溫或37℃ 1hr。
4. 加50μl 終止緩沖液終止反應(yīng)。
標(biāo)記后的探針可以直接使用或過(guò)柱純化后使用。
六、雜交
Southern 雜交一般采取的是液-固雜交方式，即探針為液相，被雜交DNA為固相。雜交發(fā)生于一定條件的溶液（雜交液）中并需要一定的溫度，可以用雜交瓶或雜交袋并使液體不斷的在膜上流動(dòng)。雜交液可以自制或從公司購(gòu)買，不同的雜交液配方相差較大，雜交溫度也不同。下面給出的為一雜交液配方：
PEG 6000 10%；SDS 0.5%；6×SSC；50%甲酰胺。該雜交液的雜交溫度為42℃。
1. 預(yù)雜交
NC膜浸入2×SSC中5min，在雜交瓶中加入雜交液（8cm×8 cm的膜加5ml即可），將膜的背面貼緊雜交瓶壁，正面朝向雜交液。放入42℃雜交爐中，使雜交體系升到42℃。取經(jīng)超聲粉碎的鮭魚精DNA（已溶解在水或TE中）100℃加熱變性5min，迅速加到雜交瓶中，使其濃度達(dá)到100μg/ml。繼續(xù)雜交4hour。鮭魚精DNA的作用是封閉NC膜上沒有DNA轉(zhuǎn)移的位點(diǎn)，降低雜交背景、提高雜交特異性。
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2. 雜交
倒出預(yù)雜交的雜交液，換入等量新的已升溫至42℃的雜交液，同樣加入變性的鮭魚精DNA。將探針100℃加熱5min，使其變性，迅速加到雜交瓶中。42℃雜交過(guò)夜。
七、洗膜與檢測(cè)
取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列條件洗膜：
2×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
1×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.5×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.2×SSC/0.1% SDS，56℃，10min；
0.1×SSC/0.1% SDS，56℃，10min。
在洗膜的過(guò)程中，不斷振搖，不斷用放射性檢測(cè)儀探測(cè)膜上的放射強(qiáng)度。實(shí)踐證明，當(dāng)放射強(qiáng)度指示數(shù)值較環(huán)境背景高1-2倍時(shí)，是洗膜的終止點(diǎn)。上述洗膜過(guò)程無(wú)論在哪一步達(dá)到終點(diǎn)，都必須停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用濾紙吸干膜表面的水份，并用保鮮膜包裹，注意保鮮膜與NC膜之間不能有氣泡。將膜正面向上，放入暗盒中（加雙側(cè)增感屏），在暗室的紅光下，貼覆兩張X光片，每一片都用透明膠帶固定，合上暗盒，置-70℃低溫冰箱中曝光。根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱決定曝光時(shí)間，一般在1-3天時(shí)間。洗片時(shí)，先洗一張X光片，若感光偏弱，則再多加兩天曝光時(shí)間，再洗第二張片子。
影響Southern雜交實(shí)驗(yàn)的因素很多，主要有：DNA純度、酶切效率、電泳分離效果、轉(zhuǎn)移效率、探針比活性和洗膜終止點(diǎn)等。
常見問題
Q1：探針標(biāo)記物的分類有幾種？
A1：（1）探針標(biāo)記物有放射性核素與非放射性物質(zhì)兩種。放射性核素標(biāo)記敏感性高，可檢測(cè)pg水平的核酸，但因不易長(zhǎng)期保存，且存在放射性污染等問題，現(xiàn)已較少應(yīng)用。
（2）非放射性物質(zhì)常用的有*等，非放射性探針安全、穩(wěn)定、操作方便并且經(jīng)濟(jì)，但敏感性較低，近年來(lái)，由于雜交信號(hào)檢測(cè)方法的改進(jìn)，檢測(cè)的敏感性得到了很大提高。
Q2：怎樣確定探針的濃度？
A2：總的來(lái)說(shuō)，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。要獲得較滿意的敏感性，膜核酸分子雜交中放射性核素標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)記探針的用量分別為5-10 ng/ml和25-1000 ng/ml，而原位雜交中，無(wú)論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為0.5-5.0 μg/ml。
Q3：如何選擇核酸分子雜交的zui適溫度？
A3：核酸分子雜交技術(shù)zui重要的因素之一是選擇zui適的核酸分子雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm 10-15 ℃，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30 ℃），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個(gè)同源性在50%左右或更低些的DNA，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗(yàn)，即zui適復(fù)性溫度、苛刻復(fù)性溫度及非苛刻復(fù)性溫度。zui適復(fù)性溫度：Tor =Tm–25 ℃苛刻復(fù)性溫度：Ts = Tm – (10或15 ℃)非苛刻復(fù)性溫度：Tns =Tm – (30或35 ℃)
Q4：核酸雜交篩選寡核苷酸探針遵循哪些原則？
A4：（1）長(zhǎng)18-50 nt，較長(zhǎng)探針雜交時(shí)間較長(zhǎng)，合成量低；較短探針特異性會(huì)差些。
（2）堿基成分：G+C含量為40%-60%，超出此范圍則會(huì)增加非特異核酸雜交。
（3）探針分子內(nèi)不應(yīng)存在互補(bǔ)區(qū)，否則會(huì)出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。
（4）避免單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)（不能多于4個(gè)），如-CCCCC-。
（5）一旦選定某一序列符合上述標(biāo)準(zhǔn)，將序列與核酸庫(kù)中核酸序列比較，探針序列應(yīng)與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不能超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)或更多的堿基的同源，否則，該探針不能用。
Q5：合成的寡核苷酸探針具有哪些優(yōu)點(diǎn)？
A5：（1）由于鏈短，其序列復(fù)雜度低，分子量小，所以和等量靶位點(diǎn)*雜交的時(shí)間比克隆探針短，如20 nt的寡核苷酸探針在濃度為100 ng/ml，靶序列為1-100 pg、1 kb片段時(shí)，達(dá)到zui大程度的核酸分子雜交只需10 min，而用2 kb的克隆探針在同樣條件下達(dá)到*核酸分子雜交則需16 hour。
（2）寡核苷酸探針可識(shí)別靶序列內(nèi)1個(gè)堿基的變化，因?yàn)槎烫结樦袎A基的錯(cuò)配能大幅度地降低雜交體的Tm值。
（3）一次可大量合成寡核苷酸探針（1-10 mg），使得這種探針價(jià)格低廉，與克隆探針一樣，寡核苷酸探針能夠用酶學(xué)或化學(xué)方法修飾以進(jìn)行非放射性標(biāo)記物的標(biāo)記。盡管克隆探針較特異，但通過(guò)細(xì)心篩選序列或選擇相對(duì)長(zhǎng)的序列（＞30 nt）也可設(shè)計(jì)出非常特異的寡核苷酸探針。zui常用的寡核苷酸探針有18-40個(gè)堿基，目前的合成儀可有效地合成至少50個(gè)堿基的探針。
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