MV & Exosomes分離流程
流程總覽(此流程以細胞培養(yǎng)液 CCM來源為例)
1.前處理:去除細胞、死細胞、細胞碎屑
2.MV收集:方法A(10000 xg差速離心)或方法B(TFF-MV切向流過濾)
3. exosome 純化:過 0.22 μm濾膜 →TFF-EVs 濃縮/洗滌回收
操作步驟
1. 前處理(Removal of cells / dead cells / debris)
1. 離心 300 xg，10 min，4℃，取上清。
2. 離心 2,000 xg，10-20min，4℃，取上清。
可視情況再離心5,000-8,000 xg，10min以降低后續(xù)堵膜風(fēng)險。
II. 收集MV(microvesicles / large EVs)
方法 3A:差速離心
3A-1. 離心 10,000 xg，30 min，4℃，沉淀為MV pellet，以1~2 mL PBS 輕柔回溶。
Ps.若追求較高純度，可再以10,000 xg，10 min，4℃洗一次。
方法 3B:切向流過濾 (建議用于中大體積，放大量最友善)
3B-1.將「步驟2 上清」上TFF-MV(150nm)，并收集過濾液(filtrate) 供后續(xù)
exosome 純化使用。
3B-2.CCM 過濾后，以1~2倍體積的PBS沖洗裝置1~2次，棄洗滌液。3B-3.關(guān)閉過濾端，以定量PBS(如2mL)重覆沖洗卡匣后回收MV(自滯留端)。
IIl.純化 exosome ( small EVs )
4.取 3A-1上清液或3B-1過濾液，經(jīng)0.22μm無菌濾膜過濾，去殘留大顆粒。
5.取步驟 4過濾液上TFF-EVs(50 nm)，以1~2倍體積PBS 沖洗數(shù)次，棄洗滌液。
6.關(guān)閉過濾端，以定量PBS(如2mL)重覆沖洗卡匣后回收exosomes(自滯留端)。
