蘇州乾蕓儀器科技有限公司
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閱讀：793發(fā)布時間：2014-10-8
MTT完整漢語化學(xué)名為 3-(4，5-mtt二甲基噻唑-2)-2，五二苯基四氮唑溴鹽，商品名：mtt噻唑藍。是一種黃色彩的染料。
MTT比色法，是一種檢查細(xì)胞存活和生長的辦法。其檢查原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT康復(fù)為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功用。二甲基亞砜(DMSO)，其作用是能夠溶解細(xì)胞中甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢查儀在490nm波利益測定其光吸收值就可反映活細(xì)胞數(shù)量。在必定細(xì)胞數(shù)方案內(nèi)，MTT結(jié)晶構(gòu)成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該辦法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢查、大方案的抗腫瘤藥物挑選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射活絡(luò)性測定等。它的特點是活絡(luò)度高、經(jīng)濟。缺點：因為MTT經(jīng)康復(fù)所發(fā)生的甲瓚商品不溶于水，需被溶解后才調(diào)檢查。這不只使工作量增加，也會對試驗作用的準(zhǔn)確性發(fā)生影響，而且溶解甲的有機溶劑對試驗者也有危害。
MTT 溶液的制作辦法
通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因而，能夠稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液(PBS)或無酚紅的培育基中，用0.22μm濾膜過濾以除掉溶液里的細(xì)菌，放4℃ 避光保留即可。在制作和保留的進程中，容器用鋁箔紙包住。試驗的時分我通常封閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。
需求留神的是，MTT法只能用來檢查細(xì)胞相對數(shù)和相對生機，但不能測定細(xì)胞必定數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢查作用的時分，為了確保試驗作用的線性，MTT 吸光度在0-0.7 方案內(nèi)。
MTT通?，F(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4oC避光保留兩周內(nèi)有效，或制作成5mg/ml保留在-20度長期保留，防止重復(fù)凍融，小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光防止分化。我通常都把MTT粉分裝在EP管里，用的時分現(xiàn)配，直接往培育板中加，沒必要一瞬間配那么多,特別當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就必定不能再用了。
MTT有致癌性，用的時分留神,有條件帶那種通明的簿膜手套.配成的MTT需求無菌，MTT對菌很活絡(luò);往96孔板加時不避光也沒有聯(lián)絡(luò)，究竟時刻較短，或許你不放心的時分能夠把操作臺上的照明燈關(guān)掉.
制作MTT時用PBS(ph=7.4)溶解。PBS配方：Nacl 8g + Kcl 0.2g + Na2HPO4 1.44g + KH2PO4 0.24g調(diào)pH 7.4,定容1L。
通常MTT法試驗進程：
1：接種細(xì)胞：用含10% 胎小牛血清 得培育液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔1000-10000個細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul.
2: 培育細(xì)胞：同通常培育條件，培育3-5天(可依據(jù)試驗?zāi)康暮托枨筇暨x培育時刻)。
3：呈色：培育3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS制作，pH=7.4)20ul.持續(xù)孵育4 h，
連續(xù)培育，留神吸棄孔內(nèi)培育上清液，關(guān)于懸浮細(xì)胞需求離心后再吸棄孔內(nèi)培育上清液。每孔加150ul DMSO，振動10min，使結(jié)晶物充沛融解。
4：比色：挑選490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記載作用，以時刻為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)制作細(xì)胞生長曲線。
藥物MTT法試驗進程
貼壁細(xì)胞：
1: 搜集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔參加100ul,鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度 1000-10000 孔，(邊際孔用無菌PBS填充)。
2: 5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),參加濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時刻，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.通常5-7個梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個復(fù)孔.主張設(shè)5個，不然難以反響真實情況
3: 5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下查詢。
4: 每孔參加20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，持續(xù)培育4h。若藥物與MTT能夠反響，可先離心后棄去培育液，留神用PBS沖2-3遍后，再參加含MTT的培育液。
5: 連續(xù)培育，留神吸去孔內(nèi)培育液。
6: 每孔參加150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振動10min，使結(jié)晶物充沛溶解。在酶聯(lián)免疫檢查儀OD490nm處丈量各孔的吸光值。
7: 一起設(shè)置調(diào)零孔(培育基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培育液、MTT、二甲基亞砜)。
懸浮細(xì)胞：
1: 搜集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)度細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a足的1640(無血清)培育基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培育液稀釋 (儲存液100mg/ml，需預(yù)試尋覓稀釋度，1:10-1:20);③需檢查物10ul;④細(xì)胞懸液50ul(即5×104cell/孔)，共100ul參加到96孔板(邊際孔用無菌水填充)。每板設(shè)對照(加100ml 1640)2: 置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下查詢。
3: 每孔參加10 ul MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，持續(xù)培育4 h。(懸浮細(xì)胞推薦運用WST-1，培育4 h后可越過進程4)，直接酶聯(lián)免疫檢查儀OD570nm(630nm校準(zhǔn))丈量各孔的吸光值)
4、離心(1000轉(zhuǎn)x10min)，留神吸掉上清，每孔參加100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振動10 min，使結(jié)晶物充沛溶解。在酶聯(lián)免疫檢查儀OD570nm(630nm校準(zhǔn))丈量各孔的吸光值。
5、一起設(shè)置調(diào)零孔(培育基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培育液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定3復(fù)孔。
留神事項：
(1) 挑選適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。
(2) 防止血清干擾：通常選小于10%的胎牛血清的培育液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)剩下培育液。
(3) 設(shè)空白對照：與試驗平行不加細(xì)胞只加培育液的空白對照。其他試驗進程保持一致，究竟比色以空白調(diào)零。
(4) MTT試驗吸光度究竟要在0-0.7之間，超出這個方案就不是直線聯(lián)絡(luò)。
(5) 用96孔板培育細(xì)胞做MTT測細(xì)胞生機,應(yīng)當(dāng)加多少1640培育基,多少MTT和DMSO適合依據(jù)書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培育液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進行比色測定
(6) 通常每孔4000個細(xì)胞為宜，既細(xì)胞濃度在20000個/ml，MTT加20ul，作用四小時后洗掉上清液，留神不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振動10分鐘，然后測吸光值。
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