組織沉默調(diào)節(jié)蛋白 3 （SIRT3）活性熒光定量檢測試劑盒（中文版）

主要用途

組織沉默調(diào)節(jié)蛋白 3 （SIRT3）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過熒光探針氨甲基香豆su標(biāo)記人工合成的乙?；?p53 多肽底物，經(jīng)過 SIRT3 脫乙?；?，被位點(diǎn)特異性氨基肽酶水解，釋放釋放出具有強(qiáng)烈熒 光的 7-氨-4 甲基香豆su，即采用熒光法來測定組織裂解萃取樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技 術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、線粒體蛋白樣品、 部分或*純化酶樣品中 SIRT3 的活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用， 操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

人體組蛋白脫乙?；福?/span>histone deacetylase；HDAC）家屬分成三類共20多個(gè)蛋白：種類I（class I）與酵母 Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8，存在于細(xì)胞核中；種類II（class II）與酵母Hda1蛋白同源，包括 HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于細(xì)胞核和細(xì)胞漿里；上述兩大種類的蛋白分子催化 結(jié)構(gòu)域含有鋅，且曲古菌素A（trichostatin A；TSA）敏感。種類III（class III）為NAD+輔助因子必需，又稱為sirtuins，與酵母Sir2（Silent Information Regulator 2）同源，是進(jìn)化保留的古老的酶類，存在于真核生 物、古生菌（Archaea）和真細(xì)菌（Eubacteria）等，包括SIRT1至7等，為曲古菌素A（trichostatin A；TSA） 不敏感型賴氨酸脫乙酰基酶（lysyl-deacetylase）。催化賴氨酸脫乙?；磻?yīng)，以及由NAD+和乙酰（acetyl） 基團(tuán)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的*（nicotinamide）和O-乙酰ADP核糖（O-acetyl-ADP-ribose）。其中可溶性SIRT3位于 細(xì)胞線粒體內(nèi)，體內(nèi)熱量限制（caloric restriction）、寒冷刺激、細(xì)胞應(yīng)激等因素，使成熟且活性Sirt3由細(xì)胞 核轉(zhuǎn)移到線粒體，經(jīng)基質(zhì)加工肽酶（matrix-processing peptidase）激活，表達(dá)增加，作用于乙酰輔酶A合酶2 （acetyl CoA synthetase 2）、UCP1、PGC-1α等天然目標(biāo)底物，脫乙酰化和激活。其功能在于調(diào)節(jié)適應(yīng)性生 熱反應(yīng)（thermogenesis）、確保能量產(chǎn)生、提供乙酸的代謝使用、調(diào)節(jié)基礎(chǔ)ATP水平、調(diào)節(jié)影響線粒體通透 性的凋亡信號、調(diào)節(jié)表觀遺傳基因沉默，是代謝或氧化狀態(tài)的感應(yīng)因子，生命延長（life extension）的標(biāo)志。 Sirt3異常，將導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病、癌癥、衰老、代謝功能異常等疾病?；谌斯ず铣傻囊阴；?/span>p53多肽底 物Ac- Gln-Pro -Lys-Lys（Ac）具有抗氨基肽酶切離的功能，首先使用熒光染料氨甲基香豆su（aminomethylcoumarin；AMC）來標(biāo)記乙酰化p53多肽底物，其次進(jìn)行脫乙酰化，后底物進(jìn)一步在氨基肽酶的催化酶解，釋放出具有強(qiáng)烈熒光的7-氨-4甲基香豆su（7-amino-4-methylcoumarin；AMC）（激發(fā)波長350-360nm；散發(fā)波長450-465nm），由此來定量測定沉默調(diào)節(jié)蛋白3的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A） 毫升

裂解液（Reagent B） 毫升

緩沖液（Reagent C） 毫升

底物液（Reagent D） 微升

終止液（Reagent E） 微升

酶解液（Reagent F） 微升

補(bǔ)充液（Reagent G） 微升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H） 微升2

產(chǎn)品說明書 1 份

保存方式

保存緩沖液（Reagent C）、底物液（Reagent D）、終止液（Reagent E）、酶解液（Reagent F）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在 4℃冰箱里；底物液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）避免光照，有效保證 6 月

用戶自備

1.5 毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

5 毫升 DOUNCE 勻漿器：用于裂解細(xì)胞

（微型）臺式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

黑色 96 孔板或 100 微升 1 厘米光徑比色皿：用于反應(yīng)和熒光分析的容器

熒光酶標(biāo)儀或熒光分光光度儀：用于熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

一、樣品準(zhǔn)備（線粒體蛋白）

1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定 500 毫克組織重量

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入 xx 毫升清理液（Reagent A）清洗 1 次

4． 加入 xx 毫升裂解液（Reagent B）

5． 移入到預(yù)冷的 5 毫升 DOUNCE 勻漿器

6． 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約 20 至 40 下）

7． 將所有細(xì)胞勻漿物移入 1.5 毫升離心管

8． 放進(jìn) 4℃微型臺式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 1500g

9． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的 1.5 毫升離心管

10．放進(jìn) 4℃微型臺式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 10000g

11．小心抽去上清液，保留沉淀顆粒

12．加入 xx 微升裂解液（Reagent B），充分混勻

13．移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

14．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如線粒體蛋白或純化酶樣品等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀或熒光分光光度儀（溫度為 30℃）：激發(fā)波長 350-360nm；散發(fā)波長 450-465nm

3． 緩沖液（Reagent C）置于室溫下均衡溫度

4． 準(zhǔn)備好 5 個(gè) 1.5 毫升離心管，標(biāo)記為 1 至 5 號管3

5． 分別加入 xx 微升緩沖液（Reagent C）到 1 至 5 號管

6． 移取 xx 微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到 1 號管，混勻

7． 小心移取 xx 微升 1 號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到 2 號管，混勻

8． 小心移取 xx 微升 2 號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到 3 號管，混勻

9． 小心移取 xx 微升 3 號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到 4 號管，混勻

10．將 1 至 5 號管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

管號 緩沖液（Reagent C） 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H） 標(biāo)準(zhǔn)氨甲基香豆su濃度

1 xx 微升 xx 微升 xx 微摩爾/升

2 xx 微升 xx 微升 1 號管 xx 微摩爾/升

3 xx 微升 xx 微升 2 號管 xx 微摩爾/升

4 xx 微升 xx 微升 3 號管 xx 微摩爾/升

5 xx 微升 0 0

三、標(biāo)準(zhǔn)測定

1． 在黑色 96 孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品 1 至 5 管

2． 分別移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里

3． 分別加入 xx 微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）

4． 輕輕搖動(dòng)黑色 96 孔板 30 秒

5． 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀或轉(zhuǎn)移到 100 微升比色皿，在熒光分光光度儀里檢測：獲得相對熒光單位（Relative Fluorescence Unit；RFU）讀數(shù)

6． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為相對熒光單位（RFU）；橫座標(biāo)（X 軸）為標(biāo)準(zhǔn)氨甲基香豆su濃度（微 摩爾/升）

四、活性測定

1． 在黑色 96 孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景空對照和待測樣品

2． 分別移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里

3． 分別加入 xx 微升底物液（Reagent D）

4． 分別加入 xx 微升補(bǔ)充液（Reagent G）或待測樣品（50 微克線粒體蛋白或 200 微克細(xì)胞裂解萃取液總 蛋白）（注意：樣品須清澈）

5． 輕輕搖動(dòng)黑色 96 孔板 30 秒

6． 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里，孵育 60 分鐘，避免光照

7． 分別加入 xx 微升終止液（Reagent E）

8． 分別加入 xx 微升酶解液（Reagent F）

9． 輕輕搖動(dòng)黑色 96 孔板 30 秒

10．在 30℃培養(yǎng)箱里，孵育 30 分鐘

11．即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀或轉(zhuǎn)移到 100 微升 1 厘米光徑比色皿，在熒光分光光度儀里檢測：獲得相對熒光 單位（Relative Fluorescence Unit；RFU）讀數(shù)

12．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)氨甲基香豆su濃度（微摩爾/升）

四、 計(jì)算樣品活性

方法一：RFU 直接法4

根據(jù)樣品的熒光讀數(shù) RFU 作為樣品酶活性單位

方法二：標(biāo)準(zhǔn)氨甲基香豆su濃度測算法

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為 20 次操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，標(biāo)準(zhǔn)測定只需 1 次

4． 注意增益倍數(shù)的設(shè)置

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要

6． 樣品處理時(shí)，避免使用蛋白酶抑制劑、PMSF、烷基胺（alkyl amine）等

7． 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測定

8． 測定值由低到高變化；測定持續(xù) 60 分鐘

9． 測定值熒光讀數(shù)越高，表明酶活性越高

10．熒光測定后，比色皿須清洗*

11．待測樣本為線粒體蛋白樣品，其蛋白濃度為 50 微克/20 微升；待測樣本為細(xì)胞裂解懸液，其蛋白濃度為 200 微克/20 微升（本公司提供 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 GMS30030.1）

12．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

13．樣品活性計(jì)算根據(jù)用戶要求，選擇直接法或測算法；如果選擇直接法，可以不必測定標(biāo)準(zhǔn)樣品

14．沉默調(diào)節(jié)蛋白 3 單位活性定義為：在 30℃，pH 8.0 條件下，每分鐘內(nèi)能夠釋放 1 納摩爾氨甲基香豆su所需的酶量作為一個(gè)活性單位

15．本公司提供系列組蛋白脫乙酰基酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

使用承諾

秉著“信譽(yù)*、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后 10 天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問題，請立即以書面形式（實(shí)驗(yàn)報(bào)告）與本公司聯(lián)系，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗(yàn)確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯(cuò)誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

訂購信息5

單組分訂購信息

編號 名稱 規(guī)格

GMS50290.2 組織沉默調(diào)節(jié)蛋白 3（SIRT3）活性熒光定量檢測試劑盒 20 次

GMS50290.2A 清理液（Reagent A） 毫升

GMS50290.2B 裂解液（Reagent B） 毫升

GMS50290.2C 緩沖液（Reagent C） 毫升

GMS50290.2D 底物液（Reagent D） 微升

GMS50290.2E 終止液（Reagent E） 毫升

GMS50290.2F 酶解液（Reagent F） 毫升

GMS50290.2G 補(bǔ)充液（Reagent G） 毫升

GMS50290.2H 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H） 微升

試劑盒訂購信息

產(chǎn)品編號 名稱 規(guī)格

GMS50287.1 細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白 1 （SIRT1）活性比色法定量檢測試劑盒 20 次

GMS50287.2 組織沉默調(diào)節(jié)蛋白 1 （SIRT1）活性比色法定量檢測試劑盒 20 次

GMS50288.1 細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白 3（SIRT3）活性比色法定量檢測試劑盒 20 次

GMS50288.2 組織沉默調(diào)節(jié)蛋白 3（SIRT3）活性比色法定量檢測試劑盒 20 次

GMS50289.1 細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白 1（SIRT1）活性熒光定量檢測試劑盒 20 次

GMS50289.2 組織沉默調(diào)節(jié)蛋白 1（SIRT1）活性熒光定量檢測試劑盒 20 次

GMS50290.1 細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白 3（SIRT3）活性熒光定量檢測試劑盒 20 次

GMS50290.2 組織沉默調(diào)節(jié)蛋白 3（SIRT3）活性熒光定量檢測試劑盒 20 次