大鼠角鯊烯環(huán)氧化酶（SE）酶聯(lián)免疫分析(ELISA) 試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定大鼠血清、血漿、組

織勻漿及相關(guān)液體樣本中角鯊烯環(huán)氧化酶（SE）的含量。

實驗原理：

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中大鼠角鯊烯環(huán)氧化酶（SE）水平。用純化的大鼠角鯊烯環(huán)氧化酶（SE）捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入大鼠角鯊烯環(huán)氧化酶（SE），再與 HRP 標記的檢測抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠角鯊烯環(huán)氧化酶（SE）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中大鼠角鯊烯環(huán)氧化酶（SE）含量。

試劑盒組成：

試劑盒組成 48 孔配置 96 孔配置 保存

說明書 1 份 1 份

封板膜 2 片 2 片

密封袋 1 個 1 個

酶標包被板 1×48 1×96 2-8℃保存

標準品 0.3ml×6 管 0.3ml×6 管 2-8℃保存

酶標試劑 5 ml×1 瓶 10 ml×1 瓶 2-8℃保存

樣品稀釋液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存

顯色劑 A 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存

顯色劑 B 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存

終止液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存

20×濃縮洗滌液 15ml×1 瓶 25ml×1 瓶 2-8℃保存

注：標準品濃度依次為：120、60、30、15、7.5、0 U/L.

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次

離心。

3. 尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)2 /分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到 100 萬/ml 左右。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7. 不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1. 標準品的加樣：設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品 50μL；。

2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl（樣品終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 加酶：每孔加入酶標試劑 100μl，空白孔除外。

4. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 60 分鐘。

5. 配液：將 20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 20 倍稀釋后備用。

6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。

7. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色 15 分鐘.

8. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

9. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應(yīng)在加終止液后 15 分鐘以內(nèi)進行。

注意事項：

1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2． 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。

3． 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在 5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，*使用排槍加樣。

4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本 OD 值大于標準品孔孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計算時請后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6． 底物請避光保存。

7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9． 本試劑不同批號組分不得混用。

10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。計算：

以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的 OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù) R 值為 0.95 以上。

2.批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于 10%和 15% 。

檢測范圍：

3.75 U/L - 120 U/L

靈敏度：

低檢測濃度小于 0.1 U/L

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存： 2-8℃。

2．有效期： 6 個月